WSTĘP

Alergia na jad owadów błonkoskrzydłych, która u 3-7% ludzi przybiera postać ciężkiej reakcji anafilaktycznej, jest głównym i niekwestionowanym wskazaniem do swoistej immunoterapii jadem owadów (VIT, venom immunotherapy) [1, 2]. Ten sposób leczenia radykalnie zmniejsza ryzyko wystąpienie objawów alergicznych po kolejnym użądleniu przez owada u osób z IgE-zależną nadwrażliwością na jad pszczół, os i szerszeni.

Immunoterapia jadem jest równocześnie uznanym modelem do badania mechanizmów wzbudzania i podtrzymywania tolerancji immunologicznej na alergen. W przebiegu VIT dochodzi do zahamowania rozwoju zarówno fazy wczesnej (EAR, early allergen response), jak również fazy późnej (LAR, late allergen response) odpowiedzi na alergen. Bardzo interesującym modelem do badań zmian immunologicznych zachodzących podczas immunoterapii jadem w fazie LAR jest obserwacja in vivo przebiegu prowokacji alergenem w obrębie tkanek eżektorowych, np. skóry, podczas późnej fazy odpowiedzi na alergen. Wiadomo, że już we wczesnych stadiach immunoterapii zmienia się nie tylko wielkość odczynu skórnego, ale także zmienia się skład nacieku komórkowego i profil cytokin uwalnianych in situ w miejscu prowokacji swoistym alergenem [3-7]. W mechanizmie rozwoju tolerancji na alergen w przebiegu immunoterapii swoistym alergenem, podkreślana jest w ostatnich latach rola histaminy [8]. Histamina, dotychczas uważana za kluczowy mediator reakcji zapalenia i nadwrażliwości, jest obecnie traktowana również jako mediator regulujący odpowiedź na alergen limfocytów Th1, Th2 i T reg. Poprzez wpływ na receptor H1 histamina zwiększa odpowiedź typu Th1, podczas gdy oddziaływując na receptor H2 wywiera hamujący wpływ zarówno na odpowiedź typu Th1, jak Th2 [9]. Wykazano, że ekspresja receptorów histaminowych ulega zmianom w przebiegu immunoterapii swoistym alergenem, także jadem owadów, a podanie leków blokujących receptor H1 może wywierać wpływ na skuteczność szczepienia [10-12].

Celem badania była ocena wpływu premedykacji terfenadyną, lekiem blokującym receptor histaminowy typu H1, na odpowiedź IL-10 uwalnianej pod wpływem prowokacji swoistym alergenem podczas późnej fazy odpowiedzi alergicznej w skórze u osób poddanych immunoterapii jadem owadów.

MATERIAŁ I METODY

Grupa badana

Do badania zakwalifikowano 36 pacjentów z historią reakcji anafilaktycznej o nasileniu III-IV stopnia, według klasyfikacji Muellera, po użądleniu przez owada. Wszyscy zakwalifikowani do badania mieli dodatni test skórny z jadem owada (sprawcą reakcji alergicznej) w stężeniu 106 g/l oraz sIgE w surowicy przeciwko temu jadowi. Przeciwwskazanie do udziału w badaniu stanowiły: ciąża i okres karmienia, ciężkie schorzenia układowe i psychiatryczne, zażywanie betablokerów i inhibitorów ACE oraz leczenie preparatami przeciwhistaminowymi i glikokortykosteroidami w okresie miesiąca przed rozpoczęciem VIT.

U 22 osób zakwalifikowanych do immunoterapii jadem wdrożono leczenie terfenadyną (TF) w dawce 180 mg. Leczenie rozpoczynano 7 dni przed rozpoczęciem VIT: dzień (-7) i kontynuowano do 45 dnia trwania szczepień (dzień 45). U pozostałych pacjentów (N=14) VIT przeprowadzono bez premedykacji lekiem przeciwhistaminowym.

U wszystkich pacjentów przeprowadzono immunoterapię jadem owadów metodą ultra-rush. U 2 pacjentów z grupy premedykowanej TF i 2 pacjentów z grupy bez premedykacji nie ukończono fazy wstępnej szczepień (VIT-UR), z powodu wystąpienia powikłań uniemożliwiających realizację protokołu szczepień i podanie pełnej dawki jadu (101,1 mcg). Do dalszego etapu badania zakwalifikowano 20 osób z grupy premedykowanych TF i 12 osób nie otrzymujących premedykacji przed VIT. Charakterystyka demograficzna grupy badanej przedstawiona jest w tabeli I.

Protokół szczepień jadem

Szczepienia przeprowadzono według zmodyfikowanego protokołu Birnbauma i wsp. [13]. Kumulacyjną dawkę jadu, 101,1 mcg podzieloną na 6 iniekcji, podano w ciągu 3,5 godziny (dzień 1). Dawka wstępna wynosiła 0,1 mcg, kolejne 1, 10 i 20 mcg podawano co 30 minut, dawki 30 i 40 mcg co 60 minut. Kolejna dawka, podawana po 2 tygodniach (dzień 15) wynosiła 100 mcg i podzielona była na dwie dawki po 50 mcg każda, podawane co 30 min. Dawki podtrzymujące w wysokości 100 mcg podano co 30 dni (pierwsza – dzień 45).

Test komór skórnych

U wszystkich pacjentów wykonano test prowokacyjny z jadem metodą komór skórnych: przed VIT-UR (dzień -7). W grupie, która ukończyła VIT-UR test ten wykonano także po 70 dniach od zakończenia fazy wstępnej szczepień (dzień 75). W płynie z komór skórnych oznaczano IL-10.

Test prowokacji skóry metodą komór skórnych przeprowadzono według metody opracowanej przez Zweimana i wsp. [14]. W skrócie: na zdezynfekowanej skórze wewnętrznej powierzchni przedramienia umieszczano plastikową prostokątną płytkę z dwoma cylindrycznymi wgłębieniami, połączoną przewodem z pompą ssącą (Dermavac suction unit, Peter Bjerring Marselisborg Hospital, Arrhus, Denmark). Rękę ogrzewano przy pomocy poduszki elektrycznej z termostatem. Po 60-90 minutach ssania (290 mmHg) formowały się dwa pęcherzyki o średnicy 8 mm. Po aseptycznym ścięciu pęcherzyka i przemyciu roztworem soli fizjologicznej, na jego dno nakładano komorę skórną o średnicy 9 mm (Department of Physiology and Pharmacology Division of Physiology Karolinska Institute). Komory umocowywano do skóry przy pomocy plastra i pozostawiano na 4 godziny. Do wnętrza komór podawano jad owada (pszczoły lub osy w zależności od uczulenia, Pharmalgen, Alk, Denmark) w stężeniu 10-4 g/l i w objętości 0,5 ml. Roztwór jadu był przygotowywany ex tempore. Po 4 godzinach inkubacji aspirowano płyn z wnętrza komory. Płyn przechowywano w temperaturze -70°C do czasu dalszych analiz.

Testy śródskórne z jadem i testy prick z alergenami wziewnymi

Test śródskórny z jadem owada wykonywano na dłoniowej powierzchni przedramienia. Podawano jad owada odpowiedzialnego za reakcję alergiczną w objętości 0,02 ml i stężeniu10-6 g/l (Bee and Wasp venom, Pharmalgen, Alk-Abello, Denmark). Kontrolę dodatnią stanowił test z histaminą, a ujemną test z rozpuszczalnikiem do jadu.

Ocena cytokin w płynie z komór skórnych

Stężenia IL-10 były mierzone przy pomocy testów ELISA (Quantikine R&D Systems Inc., Minneapolis, USA).

Analiza statystyczna

Porównanie zmian stężeń cytokin w obrębie grup przeprowadzono przy użyciu testu kolejności par Wilcoxona. Dla porównania stężeń cytokin pomiędzy grupą otrzymującą premedykację lekiem przeciwhistaminowym, a grupą bez premedykacji, użyto testu Manna-Whitney’a.

WYNIKI

Analiza stężenia IL-10

Wyniki stężenia IL-10 w płynie z komór skórnych przed i po VIT-UR przedstawiono w tabelach III i IV. W całej grupie badanych (N=32) w 75 dniu, VIT występował blisko dwukrotny wzrost stężenia IL-10 pod wpływem prowokacji swoistym alergenem (p=0,00001) w stosunku do wartości przed leczeniem. Wzrost stężenia IL-10 stwierdzono zarówno w grupie VIT z premedykacją TF (p=0,00008), jak i w grupie pacjentów poddanych VIT bez poprzedzającej premedykacji lekiem przeciwhistaminowym (p=0,002). Pomiędzy obiema grupami nie występowały różnice w stężeniu IL-10 zarówno przed VIT-UR, jak i po leczeniu (odpowiednio p=0,92 i p=0,16).

DYSKUSJA

Głównym celem naszego badania była ocena, czy zastosowanie premedykacji lekiem blokującym receptor H1 we wstępnej fazie immunoterapii (w fazie wzrostu dawek alergenu), ma wpływ na odpowiedź in vivo IL-10. Pomimo, że w przeprowadzonych dotychczas eksperymentach in vitro wielokrotnie wykazano, że stężenie tej cytokiny wzrasta podczas immunoterapii i ma istotny udział w mechanizmie wzbudzania tolerancji na podawany alergen, dotychczas tylko w nielicznych opracowaniach wskazywano na wzrost stężenia tej cytokiny w eksperymentach in vivo [15]. Równocześnie, według naszej wiedzy, tylko w jednym badaniu oceniano wpływ premedykacji lekami przeciwhistaminowymi na efekty immunologiczne VIT, tak więc brak jest rozstrzygnięcia, czy leki te mają wpływ na odpowiedź immunologiczną podczas immunoterapii swoistym alergenem [16].

W naszym badaniu wykazano, że po zakończeniu fazy indukcji VIT w całej badanej grupie dochodzi do znacznego wzrostu IL-10 podczas późnej fazy odpowiedzi alergicznej (LAR) po prowokacji in vivo swoistym alergenem, co potwierdza rezultaty naszych poprzednich badań. Wzrost stężenia tej cytokiny występował w każdej z badanych podgrup: zarówno u pacjentów otrzymujących terfenadynę, jak i w grupie bez premedykacji lekiem przeciwhistaminowym, ale wartości IL-10 nie różniły się pomiędzy obiema grupami po zakończeniu fazy indukcji. Wynika z tego, że w zastosowanym przez nas modelu badawczym premedykacja lekiem przeciwhistaminowym nie wpływa na stężenie cytokiny mającej kluczowe znaczenie w mechanizmie wytwarzania tolerancji na alergen. Analogiczny jest rezultat Mullera i wsp., którzy oceniali odpowiedź IL-10 po VIT-UR w nadsączu kultur PBMC stymulowanych rekombinowaną fosfolipazą A2, jednym z głównych alergenów jadu pszczoły (PLA2 -Api m1), u pacjentów poddanych VIT i premedykacji lekiem przeciwhistaminowym (lewocetyryzyną – LC) oraz otrzymujących placebo [16]. Muller i wsp. nie stwierdzili różnic w stężeniu IL-10 zarówno w dniu 21 jak 110 po VIT, pomiędzy obiema grupami. Muller i wsp. wykazali również, że dynamika odpowiedzi IL-10 nie różniła się pomiędzy grupami. Wprawdzie w dniu 21 występował wzrost IL-10 w grupie LC, a w dniu 110 w obu badanych grupach, ale w obu punktach czasowych nie stwierdzono różnic stężenia IL-10 pomiędzy grupami. Niewątpliwie na pewne odrębności wyników ma wpływ różna metodologia i protokół obu badań, a szczególnie fakt badania odpowiedzi na VIT podczas prowokacji skóry jadem w późnej fazie reakcji alergicznej. Ten model wykorzystywany uprzednio w badaniu Nasera i wsp. pozwalał nam na ocenę rezultatów prowokacji in vivo. Naser i wsp., podobnie jak my, wykazał wzrost ekspresji IL-10 w skórze po prowokacji jadem osy w LAR u pacjentów odczulanych jadem osy [17].

Niewątpliwie słabością naszego badania, szczególnie w kategorii oceny rezultatów skuteczności klinicznej premedykacji VIT lekami przeciw histaminowymi jest brak kontroli placebo, jednak pierwotnym jego celem była ocena parametrów immunologicznych. Wyniki te mają charakter wstępny i są naszym zdaniem uzasadnieniem dla podjęcia szerzej zakrojonych badań DBPC.

Podsumowując, w tym badaniu wykazano, że premedykacja terfenadyną nie wpływa na odpowiedź IL-10 we wczesnej fazie immunoterapii. Konieczna jest dalsza ocena wpływu leków tej grupy na inne parametry odpowiedzi immunologicznej podczas VIT oraz na skuteczność kliniczną VIT.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Norman Ph.S.: Immunotherapy: 1999-2004. J Allergy Clin Immunol, 2004, 113, 1013-1023.

2.    Cox L., Nelson H., Lockey R.: Allergen immunotherapy: a practice parameter second update. J Allergy Clin Immunol, 2007, 120, 3 suppl.

3.    Pienkowski M.M., Norman P.S., Lichtenstein L.M.: Suppression of late-phase skin reaction by immunotherapy with ragweed extract. J Allergy Clin Immunol, 1985, 76, 729-734.

4.    Iliopoulos O., Proud D., Adkinson F., Creticos P.S., Norman P.S., Kagey-Sobotka A., Lichtenstein L.M., Naclerio R.M.: Effects of immunotherapy on the early, late and rechallenge nasal provocation with allergen: changes in inflammatory mediators and cells. J Allergy Clin Immunol, 1991, 87, 855-866.

5.    Nish W.A., Charlesworth E.N., Davis T.L., Whisman B.A. i wsp.: The effect of immunotherapy on the cutaneous late phase response to antigen. J Allergy Clin Immunol, 1994, 93, 484-493.

6.    Francis J.N., James L.K., Paraskevopoulos G., Wong Ch., Calderon M.A., Durham S.R., Till S.J.: Grass pollen immunotherapy: IL-10 induction and suppression of late responses precedes IgG4 inhibitory antibody activity. J Allergy Clin Immunol, 2008, 121, 1120-1125.

7.    Hamid Q.A., Schotman E., Jacobson M.R., Walker S.M., Durham S.R.: Increases in Il-12 messenger RNA+ cells accompany inhibition of allergen induced late skin responses after successful grass pollen immunotherapy. J Allergy Clin Immunol, 1997, 99, 254-260.

8.    Jutel M., Watanabe T., Akdis M., Blaser K., Akdis C.A.: Immune regulation by histamine. Curr Opin Immunol, 2002, 14, 735-740.

9.    Jutel M.,Watanabe T., Klunker S., Akdis M., Thomet O.A.R., Małolepszy J.: Histamine regulates T-cell and antibody response s by deferential expression of H1 and H2 receptors. Nature, 2001, 413, 420-425.

10.    Jutel M., Zak-Nejmark T., Wrzyszcz M., Małolepszy J.: Histamine receptor expression on peripheral blond CD4+ lymphocytes is influence by ultrarush bee venom immunotherapy. Allergy, 1997, 52,  suppl 37; 88.

11.    Simons F.E.: Advances in H1 antihistamines N Engel J Med, 2005, 351, 2203-2217.

12.    Muller U., Hari Y., Bercholtold F.: Premedication with antihistamines may enhance efficacy of specific allergen immunotherapy. J Allergy Clin Immunol, 2001, 107, 81-86.

13.    Birnbaum J., Charpin D., Vervolet D.: Rapid Hymenoptera venom immunotherapy; comparative safety of three protocols. Clin Exp Allergy, 1993, 23, 226-230.

14.    Zweimann B., von Allmen C.: Temporal paterns of mediator release during developing cutaneous late-phase reaction. Clin Exp Allergy, 2000, 30, 856-862.

15.    Akdis C.A. Blesken T., Akdis M., Wuthrich B., Blaser K.: Role of IL-10 in specific immunotherapy. J Clin Invest, 1998, 102, 98-106.

16.    Muller E.R., Jutel M., Reimers A., Zumkehr J., Huber C., Kriegel C., Steiner U. i wsp.:  Clinical and immunological effects of H1 antihistamine preventive medication during honeybee venom immunotherapy. A Allaergy Clin Immunol, 2008, 122, 1001-1007.

17.    Nasser S.M., Ying S., Meng Q., Ewan P.W.: Interleukin-10 levels increase in cutaneous biopsies of patients undergoing wasp venom immunotherapy. Eur J Immunol, 2001, 31, 3704-3713.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Aneta Kowal
Klinika Pulmonologii i Nowotworów Płuc AM Wrocław
ul. Grabiszyńska 105, 53-439 Wrocław

Pracę nadesłano: 21.03.2011 r.
Przyjęto do druku: 21.04.2011 r.