Alergologia Info, 2008,III,1; 19-24

Technika płukania oskrzelowo-pęcherzykowego a wiarygodność parametrów immunologicznych

Robert Pawłowicz1*, Andrzej M. Fal1,2


1Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych i Alergologii Akademii Medycznej we Wrocławiu


2Katedra Zdrowia Publicznego Akademii Medycznej we Wrocławiu

  • Tab. I. Cytokiny w BAL w wybranych jednostkach chorobowych
  • Tab. II. Enzymy w BAL w wybranych jednostkach chorobowych

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe jest jedną z ważnych metod diagnostycznych i terapeutycznych w pulmonologii. Jako jedna z niewielu procedur umożliwia ocenę zjawisk biochemicznych i immunologicznych przebiegających w tkance płucnej. Procedurę tę przeprowadza się podczas standardowej bronchoskopii. W uzyskanym materiale określa się skład komórkowy oraz zawartość substancji biochemicznych we frakcji pozakomórkowej. Przed oznaczeniem stężeń w BALf często zagęszcza się popłuczyny, ze względu na niskie stężenia badanych substancji. Do oznaczeń wykorzystuje się metody standardowe wg protokołów producentów: ELISA (enzyme linked immunoassay), RIA (radio-immunoassay) oraz radioimmunodyfuzji. Najczęściej oznaczane są immunoglobuliny, cytokiny, enzymy (proteinazy, antyproteinazy), markery nowotworowe, oksydanty i antyoksydanty (dwutlenek azotu, dysmutaza nadtlenkowa, katalaza, glutation). Jednym z poważnych ograniczeń tej metody badawczej jest brak jej standaryzacji, co utrudnia porównywanie wyników badań z różnych ośrodków, a także ocenę dynamiki zmian stężeń i/lub aktywności.

Autorzy przedstawiają zwięźle podstawowe wskazania diagnostyczne, w których analiza składu komórkowego i humoralnego BALf bywa wykorzystywana. Zwracają uwagę na najczęstsze błędy techniki BAL będące powodem nieprawidłowych wyników.

Na podstawie swoich doświadczeń podają podstawowe zasady zmniejszające ryzyko fałszywych wyników, m.in. stosowanie standardowej ilości podawanego płynu i odpowiednie klinowanie końcówki bronchoskopu w oskrzelu, odrębne odciąganie i analiza pierwszej objętości płynu podanego podczas, jak najwcześniejsze oddzielenie przez wirowanie komórkowych składników BALf, właściwe przechowywanie supernatantów. W podsumowaniu autorzy wskazują, że już dzisiaj BALf może być źródłem wartościowych informacji immunologicznych, jednakże dalsze prace nad standaryzacją metody są konieczne, aby uczynić z niej w pełni wiarygodne narzędzie diagnostyczne.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (bronchoalveolar lavage - BAL) jest cenną metodą badawczą, diagnostyczną, a także - w pewnych sytuacjach - leczniczą w pulmonologii. Uzyskiwane podczas wykonywania tej procedury dane dotyczące składu komórkowego oraz enzymów i mediatorów występujących w cienkiej warstwie płynu wyścielającego pęcherzyki płucne (ELF - epithelial lining fluid) pozwoliły w dużym stopniu wyjaśnić zjawiska patofizjologiczne występujące w wielu chorobach płuc. Głównym ograniczeniem zastosowania tej metody w praktyce klinicznej jest jednak ciągle brak jej standaryzacji, wynika stąd trudność w porównywaniu wyników otrzymywanych przez różnych badaczy.

Substancje, których obecność stwierdzamy w płynie BAL (BALf) pochodzą z różnych źródeł: mogą być produkowane lokalnie, dostawać się do światła pęcherzyków płucnych na drodze transportu biernego (albuminy, orozomukoid) lub czynnego (IgA, IgM) [1, 2]. Określenie stężenia substancji w płynie pokrywającym powierzchnię pęcherzyków płucnych jest trudne ze względów metodologicznych, m.in. dlatego, że sam proces pobierania materiału (np. ilość wprowadzanego do pęcherzyków płucnych płynu, stopień jego odzysku) może wpływać na ich stężenie. Próbowano znaleźć tzw. „substancje referencyjne”, względem których można by określać stężenie rozpuszczalnych składników ELF. Substancja taka powinna spełniać kilka warunków, m.in. jej stężenie powinno pozostawać stałe podczas samego zabiegu płukania pęcherzyków, a przede wszystkim nie być związane z żadnymi stanami chorobowymi płuc [1]. Dotychczas nie wskazano takiej „idealnej” substancji, a najczęściej przez badaczy do takich celów stosowaną jest albumina [3]. Niestety, jej stężenia w przebiegu różnych chorób (szczególnie takich, które powodują uszkodzenie ścian naczyń włośniczkowych tkanki płucnej) mogą ulegać zmianom, które często są trudne do precyzyjnego określenia [4].

W roli substancji referencyjnej wielu badaczy „testowało” również potas [5]. Zwracano jednak uwagę, że potas może przedostawać się do popłuczyn podczas lavage’u, a także może być uwalniany z komórek znajdujących się w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych. Następnie pewne nadzieje wiązano z mocznikem [6], jednakże jego zdolność do przenikania przez błony komórkowe powoduje, że stężenie w BALf jest ściśle uzależnione od czasu, który upływa między podaniem a odciągnięciem płynu podczas płukania [7]. Jeszcze innym związkiem testowanym w tej roli był błękit metylenowy. Nie spełniał on jednak oczekiwań, m.in. ze względu na zdolność do wiązania się z komórkami tkanki płucnej [8]. Obecne wytyczne ERS (European Respiratory Society) podawanie wyników w odniesieniu do „standardowej substancji” zalecają w przypadku, gdy badane składniki występują w surowicy i są jednocześnie produkowane lokalnie w tkance płucnej w warunkach chorobowych oraz, gdy procent odzysku płynu używanego do płukania jest znacznie zmniejszony w przebiegu choroby płuc [1].

W celu uzyskania wiarygodnych i porównywalnych wyników oznaczeń składu BAL ważna jest również sama technika wykonania badania. Niepełne zaklinowanie końcówki bronchoskopu w oskrzelu powoduje „zanieczyszczenie” substancjami wydzielanymi przez nabłonek dużych oskrzeli i uzyskanie tzw. frakcji oskrzelowej, a nie pęcherzykowej. Te dwie frakcje można odróżnić za pomocą składu komórkowego i białkowego. Frakcja oskrzelowa zawiera powyżej 2% komórek nabłonka oskrzelowego oraz zwiększone stężenie IgA i laktoferyny. Białka te nie występują natomiast w pęcherzykach płucnych [9, 10]. Frakcja oskrzelowa znajduje się przede wszystkim w początkowych objętościach odzyskiwanego podczas płukania płynu (pierwszych 20-80 ml) [11]. Celem utworzenia standardu oznaczania stężeń oraz dla pewności wiarygodności wyników stężenia niekomórkowych składników popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych sam wynik powinien być zawsze uzupełniony o objętość całkowitą laważu, objętość każdej frakcji wprowadzonego płynu, objętość (procent) odzyskanego płynu, określenie obszaru drzewa oskrzelowego, z którego pochodzą popłuczyny, dane dotyczące pacjenta i jego choroby (palacz, choroby współistniejące, przyjmowane leki). Ponadto wyniki powinno się podawać w przeliczeniu na 1 mililitr odzyskanego płynu [11].

Stężenie substancji chemicznych stanowiących niekomórkową frakcję BAL często jest bardzo małe i aby była możliwość jej dokładnego pomiaru popłuczyny wymagają zagęszczenia. Do tego celu stosuje się kilka metod, najczęściej używane z nich to filtracja, liofilizacja, chemiczna ekstrakcja czy osmotyczna dializa [1]. Najbardziej popularna jest filtracja, m.in. dlatego, że jest stosunkowo łatwa i wygoda do przeprowadzenia. Może być używana jednak tylko w przypadku cząsteczek o dużej masie molekularnej; istnieje bowiem niebezpieczeństwo, że niektóre białka mogą być absorbowane na powierzchni filtrów. Ekstrakcja chemiczna znajduje zastosowanie najczęściej w przypadku oznaczania składników surfaktantu i prostaglandyn. Żadna z tych metod nie jest polecana jako referencyjna a sam proces zagęszczania może mieć wpływ na rzeczywiste stężenie badanych substancji [1].

Stężenie większości substancji oznaczane jest przy użyciu komercyjnych metod typu ELISA (enzyme-linked immunoassays), RIA (radio-immunoassays) oraz radioimmunodyfuzji. Zestawy do pomiarów są zwykle łatwo dostępne na rynku, charakteryzują się jednak zbyt małą czułością, aby były używane do badań substancji występujących w bardzo małych stężeniach w BAL. Dlatego bardzo często BAL musi zostać znacznie zagęszczony przed oznaczaniem stężeń [1].

Ogólne rekomendacje ERS [1] dotyczące oznaczania substancji biorących udział w procesach immunologicznych, jak również innych pozakomórkowych składników BAL, są następujące: całkowita objętość BAL poddawanego analizie nie powinna być mniejsza niż 80-100 ml, pierwsza objętość odciągniętego podczas płukania płynu powinna być analizowana oddzielnie, objętość płynu podanego i odzyskanego podczas badania powinna zostać odnotowana, a komórkowe składniki BAL powinny być oddzielone we wczesnym stadium obróbki laboratoryjnej popłuczyn. Ponieważ niektóre substancje (szczególnie przejawiające aktywność enzymatyczną) mogą ulegać inaktywacji i/lub zmianom strukturalnym podczas przechowywania popłuczyn, należy oznaczenia wykonywać natychmiast, bądź natychmiast po odwirowaniu zamrażać BALf w szczelnych pojemnikach do -70°C [12]. Należy zamrożone supernatanty przechowywać w objętościach potrzebnych do pojedynczych oznaczeń, ponieważ nie powinno się ponownie zamrażać raz rozmrożonych próbek (drugie zamrożenie powoduje utratę do 46% aktywności [15]).

Sposób pobierania BAL oraz ilość płynu używanego do płukania w przypadku oznaczania immunoglobulin: IgG, IgA, IgM oraz IgE (śladowe ilości) jest standardowa. Odzyskany płyn powinien być umieszczony w lodzie i możliwie szybko odwirowany. Do oznaczania używa się wysoko-czułych immunoenzymatycznych testów z przeciwciałami monoklonalnymi [13, 14]. Oznaczanie IgE może wymagać zagęszczenia BALf, co nie jest konieczne w przypadku pozostałych immunoglobulin [14]. Ze względu na obecność licznych proteaz w BALf, mogących niszczyć łańcuch immunoglobulin, zaleca się dodanie do roztworu inhibitorów proteaz [14].

Interpretacja wyników musi uwzględniać, czy dana immunoglobulina jest produkowana lokalnie czy przedostaje się do płynu z osocza, w wyniku większej przepuszczalności bariery włośniczkowo-pęcherzykowej. Można to ocenić porównując stężenia Ig w osoczu i w BALf oraz szacując efekt przepuszczalności poprzez ocenę stężenia białek o dużej masie cząsteczkowej w BALf (zwiększa się przy wzroście przepuszczalności), np.: albumina,
α2 –makroglobulina [12].

IgG w dużej mierze przechodzi do BALf z surowicy. Stężenie jej wzrasta w infekcjach toczących się lokalnie lub ogólnoustrojowo, w reakcjach odrzucenia przeszczepu (płuc, szpiku), w reakcji komórek dawcy przeciw gospodarzowi (graft v. host), w zewnątrzpochodnym alergicznym zapaleniu pęcherzyków płucnych. Zmniejszone wartości IgG natomiast stwierdzane są w zespołach obniżonej odporności, m.in. w AIDS [12].

IgA występują w dwóch postaciach: monomerycznej, która przechodzi z krwi do drzewa oskrzelowego na drodze biernej dyfuzji oraz dimerycznej, która powstaje w wyniku lokalnej sekrecji i jest związana z odpowiedzią obronną na toczące się w tkance płucnej infekcje. IgM występuje w małych ilościach w płynie z BAL. Jej zwiększone stężenie wynika głównie z przedostawania się do płuc z krwi w wyniku chorób uszkadzających tkankę płucną (np. choroby śródmiąższowe). IgE występuje w śladowych stężeniach tak, że jego oznaczenie u zdrowych ludzi wymaga specjalnego zagęszczenia płynu z BAL. Stężenie tej immunoglobuliny wzrasta m.in. w astmie, chorobach alergicznych [12].

Często, głównie dla potrzeb badań naukowych, oznacza się stężenia cytokin w BALf [15]. Podobnie jak w przypadku IgE, ich oznaczenie wymaga zagęszczenia BALf. Stosowane alternatywnie są dwie metody: oznaczanie całkowitego stężenia (najczęściej metodą ELISA) cytokin lub mierzenie ich aktywności. Pierwsza metoda ma większą specyficzność, jest łatwa w użyciu, natomiast druga ma znacznie wyższą czułość, co ma duże znaczenie, ponieważ cytokiny występują zwykle w małych stężeniach w BALf. Podstawowe zmiany w stężeniach (zwiększenie) cytokin przedstawia tabela I.

Proteinazy i antyproteinazy, które można oznaczyć w materiale z BAL to przede wszystkim elastaza i inhibitor alfa-1 proteazy (alfa-1PI) oraz metaloproteinaza i inhibitor metaloproteinazy (tabela II). Elastaza jest zwykle wykrywana w kompleksie z α1 inhibitorem proteazy przy u życiu ELISA lub technik immunoluminometrycznych (ILMA) [24, 25]. Ze względu na to, że są wykrywane tylko kompleksy elastaza- α1PZ, niskie stężenie elastazy w oznaczeniach stwierdzane jest także wtedy, gdy stężenie elastazy jest wysokie, lecz stężenie α1PI - niskie. Do oznaczania funkcjonalnej (aktywność) elastazy używa się technik chromatograficznych, ich czułość jest jednak niska i wymaga koncentracji BALf 10 do 40-krotnie. Pomiar aktywności proteolitycznej można również wykonać za pomocą metody z oczyszczoną wołową elastazą znakowaną radioizotopem H [3, 27].

Najczęściej oznaczane w BAL antygeny nowotworowe to antygen karcinoembrionalny (CEA), neurospecyficzna enolaza (NSE) oraz α-2 fetoproteina. Zmiany ich stężeń charakteryzują się jednak małą swoistością i mogą następować nie tylko w chorobach nowotworowych, ale również w wielu innych, np. CEA, w POChP, proteinozie płucnej, włóknieniu śródmiąższowym płuc. Przedstawienie szczegółowych zaleceń, co do ich użyteczności i zastosowania w szerokiej praktyce klinicznej wymaga dalszych badań [27].

W płynie z BAL można oznaczać także aktywność enzymu konwertującego angiotensynę (ACE). Jest ona zwiększona u chorych na sarkoidozę, nie ma jednak dużej użyteczności diagnostycznej, ponieważ podobne zmiany obserwuje się w wielu innych chorobach płuc [28]. Oksydanty i antyoksydanty są również grupą związków oznaczanych w BAL. Do pierwszej grupy zaliczamy m.in.: ozon, dwutlenek azotu, substancje z dymu tytoniowego, a do drugiej grupy: dysmutazę nadtlenkową, katalazę, glutation, witaminę C, witaminę E. Ich znacznie w diagnostyce jest niewielkie, a wzrost obserwuje się m.in. u palaczy tytoniu i w POChP [29].

Reasumując, BALf jest bogatym źródłem wiedzy immunologicznej i potencjalnie użytecznym narzędziem diagnostycznym i badawczym. Ze względu jednak na niewystarczającą standaryzację metody pozyskiwania materiału, nie jest powszechnie uznawanym materiałem diagnostycznym. Dodatkowy problem stanowią niskie stężenia większości obecnych w BALf substancji.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Costabel U., Daniel C., Haslam P. i wsp.: Technical recommendations and guidelines for bronchoalveolar lavage (BAL). Report of the European Society of Pneumonology Task Group on BAL. Eur Respir J 1989; 2: 561-585.

2.    Ward C., Effros R.M, Walters E.H.: Assessment of epithelial lining fluid dilution during bronchoalveolar lavage. Eur Respir Rev 1999; 9: 66: 32–37.

3.    Ward C., Duddridge M., Fenwick J. i wsp.: Evaluation of albumin as a reference marker of dilution in bronchoalveolar lavage fluid from asthmatic and control subjects. Thorax 1993; 48: 518–522.

4.    Ward C., Fenwick J., Weddle A., Booth H., Walters E.H.: Albumin is not suitable as a marker of bronchalveolar.lavage (BAL) dilution in interstitial lung disease (ILD). Eur Respir J 1997; 10: 2029–2033.

5.    Davis S., Giancola M.S., Constanza M.C. i wsp.: Analysis of sequential bronchoalveolar lavage samples from healthy human volunteers. Am Rev Respir Dis 1982; 126: 611-616.

6.    Rennard S., Basset G., Lecossier D. i wsp.: Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as a marker of dilution. J Appl Physiol 1986; 60: 532–538.

7.    Marcy T.W., Merrill W.M., Rankin J.A. i wsp.: Limitations of using urea to quantify epithelial lining fluid recovered by bronchoalveolar lavage. Am Rev Respir Dis 1987; 135: 1276–1280.

8.    Baughman R.P., Bosken C.H., Loudon R.G. i wsp.: Quantification of bronchoalveolar lavage with methylene blue. Am Rev Respir Dis 1983; 128: 266–270.

9.    Thompson A.B., Bohling T., Payvandi F. i wsp.: Lower respiratory tract lactoferrin and lysozyme arise primarily in the airways and are elevated in association with chronic bronchitis. J Lab Clin Med 1990; 115: 148–158.

10.     Merrill W., O’Hearn E., Rankin J. i wsp.: Kinetic analysis of respiratory tract proteins recovered during a sequential lavage protocol. Am Rev Respir Dis 1982; 126: 617–620.

11.    Baughman R., Rennard S.: Bronchoalveolar lavage: general approaches to correct for variability of dilution and lung permeability. Eur Resp Rev 1999; 66: 28-34.

12.    Merrill W.W., Out T.A.: Measurement of immunoglobulins in bronchoalveolar lavage fluid. Eur Resp Rev 1999; 66: 70-75.

13.    Stokes Peebles R. Jr., Liu M.C., Lichtenstein L.M. i wsp.: IgA, IgG and IgM quantification in bronchoalveolar lavage fluids from allergic rhinitis, allergic asthmatics, and normal subjects by monoclonal antibody-based immunoenzymatic assays. J Immunol Methods 1995; 179: 77–86.

14.     Merrill W.W., Naegel G.P., Olchowski J.J. i wsp.: Immunoglobulin G subclass proteins in serum and lavage fluid of normal subjects. Quantitation and comparison with immunoglobulins A and E. Am Rev Respir Dis 1985; 131: 584–587.

15.     Strieter R.M., Miller E.J., Kurdowska A.K. i wsp.: Measurement of cytokines in bronchoalveolar lavage fluid. Eur Respir Rev 1999; 9: 106–112.

16.    Mattoil S., Mattoso V.L., Soloperto M. i wsp.: Cellular and biochemical characteristics of bronchoalveolar lavage fluid in symptomatic nonallergic asthma. J Allergy Clin Immunol 1991; 87: 794-802.

17.    Jarjour N.N., Busse W.W.: Cytokines in bronchoalveolar lavage fluid of patients with nocturnal asthma. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152:1474-1777.

18.    Philips R., Wang Ph.D., Blatt L. i wsp.: Piefenidone mediates differential effects on lipopolisaccharide induced cytokine expression in human peripheral mononuclear cells. Chest 2005; 4: 169S.

19.    Virchow J.Ch, Kroegel Jr.C., Walker Ch. i wsp.: Inflammatory determinants of asthma severity: Mediator and cellular changes in bronchoalveolar lavage fluid of patients with severe asthma.
J Allergy Clin Immunol 1996; 98: S27-S40.

20.    Girgis R.E., Basha M.A., Maliarik M. i wsp.: Cytokines in the bronchoalveolar lavage fluid of patients with active pulmonary sarcoidosis. Am Respir Crit Care Med 1995; 1: 71-75.

21.     Broide D.H., Lotz M., Cuomo A. i wsp.: Cytokines in symptomatic asthma airways. J Allergy Clin Immunol 1992; 89: 958-967.

22.     Tanino M., Betsuyaku T., Tanino Y. i wsp.: Increased levels of interleukin-8 in BAL fluid from smokers susceptible to pulmonary emphysema. Thorax 2002; 57: 405-411.

23.    Howarth P., Babu K., Arshad H. i wsp.: Tumor necrosis factor (TNFα) as a novel therapeutic target in symptomatic corticosteroid dependent asthma. Thorax 2005; 60: 1012-1018.

24.    Neumann S., Gunzer G., Hennrich N. i wsp.: “PMN-elastase assay”: enzyme immunoassay for human polymorphonuclear elastase complexed with alpha 1-proteinase inhibitor. J Clin Chem Clin Biochem 1984; 22: 693–697.

25.    Boger C., Yuan H-Z, Schultek T. i wsp.: Development and clinical evaluation of immunoluminometric assays for lactoferrin and elastase-alpha- 1-proteinase inhibitor complexes in body fluids with special references to bronchoalveolar lavage and neonatal sepsis. J Clin Chem Clin Biochem 1988; 26: 645–651.

26.    Braun J., O’Connor C.: Measurement of proteases and antiproteases. Eur Resp Rev 1999; 66: 76-85.

27.    Pirożyński M., Spatafora M. i wsp.: Measurement of tumor markers, in bronchoalveolar lavage fluid. Eur Resp Rev 1999; 66: 99-105.

28.    Juillerat-Jeanneret L., Soubier F., Aubert J.D.
i wsp.: Measurement of angiotensin converting enzyme in bronchoalveolar lavage fluid. Eur Resp Rev 1999; 66: 76-85.

29.    Kelly F.J., Buhl R., Samdstrom T.: Measurement of antioxidants, oxidants and oxidation products in bronchoalveolar lavage fluid. Eur Resp Rev 1999; 66: 93-96.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Robert Pawłowicz

Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych
i Alergologii AM
50-417 Wrocław, ul. Traugutta 57/59

Pracę nadesłano: 17.01.2008 r.
Przyjęto do druku: 20.02.2008 r.