Alergologia Info, 2009,IV,2; 52-57

Alergia krzyżowa pyłku brzozy z alergenami jabłka, selera oraz marchwi przy użyciu dostępnych metod diagnostycznych

Katarzyna Napiórkowska*, Magdalena Żbikowska-Gotz, Zbigniew Bartuzi, Ewa Gawrońska-Ukleja, Jacek Mućka


Katedra i Klinika Alergologii, Immunologii Klinicznej i Chorób Wewnętrznych Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

  • Tab. I. Częstość występowania objawów niepożądanych po spożyciu jabłka, marchwi i/lub selera
  • Tab. II. Objawy niepożądane w zależności od lokalizacji
  • Tab. III. Częstość zgłaszanych objawów w zależności od spożytego pokarmu

Wstęp: U pacjentów z alergią na pyłek brzozy często rozwija się nadwrażliwość na pokarm, m.in. na jabłko, seler lub marchew. Jest ona najczęściej wynikiem alergii krzyżowej zachodzącej między tymi alergenami. Diagnostyka tego rodzaju alergii stała się możliwa dopiero dzięki zastosowaniu metod, takich jak np. immunoblotting.

Materiał i metody: Do badania zakwalifikowano 19 pacjentów uczulonych na pyłek brzozy, którzy zgłaszali jednocześnie objawy niepożądane po spożyciu jabłka, selera lub marchwi. U każdego z pacjentów wykonano testy skórne oraz oznaczono poziom IgE całkowitej oraz IgE swoistych. U wszystkich pacjentów wykonano immunoblotting celem potwierdzenia występowania alergii krzyżowej.

Wyniki: Jedynie u 3 pacjentów wykazano obecność białka przeciwko alergenowi brzozy o masie cząsteczkowej 17–18 kDa, które odpowiada głównemu alergenowi brzozy Bet v1. Natomiast tylko u 1 osoby wykazano obecność przeciwciał reagujących jednocześnie z białkami jabłka, selera i marchwi o tej samej masie cząsteczkowej, co odpowiada głównym alergenom tych pokarmów – Mal d 1, Api g 1 oraz Dau c1.   

Wnioski: Immunoblotting, pomimo znacznych ograniczeń, jest przydatną metodą diagnostyczną potwierdzającą istnienie reakcji krzyżowych.

WSTĘP

U części pacjentów uczulonych na pyłek brzozy, rozwijają się po pewnym czasie objawy nadwrażliwości na niektóre pokarmy (m.in. jabłko, seler i marchew). Zjawisko to jest następstwem odczynów krzyżowych między alergenami wziewnymi i pokarmowymi, a kontakt chorego z pierwszymi z wymienionych powoduje powstanie nadwrażliwości na inne alergeny [1].

Reakcje krzyżowe („cross-allergy”, „cross-reactivity”, alergia krzyżowa) definiuje się jako uczulenie na wspólne epitopy wiążące odpowiednie swoiste IgE różnych alergenów [2]. Alergen jednej substancji lub epitop tego alergenu jest powiązany strukturalnie z alergenem innej substancji, co powoduje, że każda z nich może wyzwolić w uczulonym organizmie objawy chorobowe. Innymi słowy, o reakcji krzyżowej mówimy wtedy, gdy przeciwciało początkowo skierowane przeciwko jednemu alergenowi, przyłącza się do podobnego alergenu pochodzącego z innego źródła. W sensie immunologicznym oznacza to, że przeciwciała IgE wytworzone w organizmie pacjenta atopowego są w stanie reagować swoiście z alergenami, które nie wzbudziły ich produkcji [3].

Diagnostyka reakcji krzyżowych opiera się na dokładnie zebranym wywiadzie oraz badaniu przedmiotowym. Należy jednak pamiętać, że zarówno co- jak i cross - allergy mogą manifestować się podobnymi objawami dotyczącymi różnych układów ustroju człowieka. Aby potwierdzić występowanie alergii przeprowadza się badania in vivo, które obejmują punktowe testy skórne, naskórkowe testy płatkowe („ atopy patch-test” ) i doustne próby prowokacji oraz badania in vitro polegające na oznaczeniu z krwi pacjenta poziomu IgE całkowitej oraz IgE alergenowo swoistych. Wszystkie wyżej wymienione metody nie różnicują jednak związków o charakterze cross-reactivity i co-reactivity. Stało się to możliwe dzięki wprowadzeniu do diagnostyki alergologicznej alergenów rekombinowanych oraz nowych technik takich jak test zahamowania RAST, immunoelektroforeza krzyżowa oraz immunoblotting [4].

Celem pracy była charakterystyka pacjentów uczulonych na pyłek brzozy, u których występują również objawy niepożądane po spożyciu jabłka, selera i/lub marchwi oraz ocena zastosowania testów skórnych prick, stężenia całkowitego IgE, IgE swoistych oraz metody immunoblottingu w diagnostyce alergii krzyżowej.

MATERIAŁ I METODY

Do badania zakwalifikowano 19 chorych, będacych pod opieką Przyklinicznej Poradni Alergologicznej oraz hospitalizowanych w Katedrze i Klinice Alergologii, Immunologii Klinicznej i Chorób Wewnętrznych, uczulonych na pyłek brzozy, u których występowały jednocześnie objawy niepożądane po spożyciu jabłka, selera i/lub marchwi.

Warunkiem kwalifikacji do badań była potwierdzona zgodnie z obowiązującymi standardami pyłkowica – tj. z uwzględnieniem wywiadu oraz dodatnich testów skórnych z pyłkiem brzozy oraz uzasadnione podejrzenie jednoczesnego współwystępowania alergii pokarmowej (badanie podmiotowe). Kryteriami wykluczającymi udział w badaniu były m.in. ciężkie, przewlekłe choroby wielonarządowe (w tym choroby układu sercowo-naczyniowego, układu oddechowego, choroby nowotworowe), choroby autoimmunologiczne, a także przyjmowanie leków steroidowych w ostatnich 6 tygodniach, immunoterapia oraz wystąpienie ciężkich objawów niepożądanych, takich jak napad astmy i wstrząs anafilaktyczny.

U wszystkich pacjentów wykonano testy skórne typu prick z użyciem gotowych ekstraktów brzozy, jabłka, selera oraz marchwi (Allergopharma), testy Prick by Prick z użyciem alergenów natywnych, oznaczono poziom całkowitego oraz swoistych IgE dla alergenów wymienionych powyżej oraz z rBet v 1 (metoda CAP-FEIA) zgodnie z obowiązującymi standardami. U wszystkich pacjentów wykonano również badanie umożliwiające potwierdzenie reakcji krzyżowych, czyli immunoblotting.

Do rozdziałów elektroforetycznych przy użyciu metody SDS PAGE zastosowano ekstrakt brzozy (firmy Allergopharma); wyciągi alergenowe z jabłka, selera oraz marchwi otrzymano ze świeżych owoców i warzyw. Tkankę rośliną po reakcji z ciekłym azotem rozcierano i poddano działaniu buforu ekstrakcyjnego o odpowiednim składzie, który zawierał inhibitory proteaz. Następnie ekstrakty nanoszono na żel, dokonywano rozdziału elektroforetycznego i przenoszono na membranę PVDF przy użyciu prądu elektrycznego. Wykrycie kompleksu antygen-swoiste przeciwciało I-rzędowe obecne w surowicy następowało dzięki użyciu przeciwciała II –rzędowego koziego antyludzkiego, połączonego z peroksydazą chrzanową – HRP (Sigma). Utworzony swoisty kompleks był wykrywany przy zastosowaniu systemu ECL (Amersham Bioscinces) oraz kliszy rentgenowskiej (Foton).

WYNIKI

W badanej grupie 19 osób było 68,5% kobiet (13osób) i 31,5% mężczyzn (6 osób). Średni wiek pacjentów wynosił 34 lata.

Niepożądane objawy po spożyciu jabłka dotyczyły 17 osób, selera 7 osób, natomiast marchwi – 9 osób. U 3 pacjentów objawy niepożądane pojawiały się po spożyciu wszystkich 3 wyżej wymienionych pokarmów (tab. I).

U pacjentów zgłaszających objawy niepożądane po spożyciu jabłka dotyczyły one najczęściej jamy ustnej (82% pacjentów) oraz układu oddechowego (47% pacjentów). Inne umiejscowienie objawów przedstawiało się następująco: przewód pokarmowy (35%), oczy (35%), wargi (23,5%) i skóra (23,5% pacjentów) (tab. II). W przypadku manifestacji objawów ze strony jamy ustnej były to najczęściej: świąd (53%), obrzęk (35%) oraz pieczenie ( 29%) (tab. III).

U pacjentów zgłaszających objawy niepożądane po spożyciu selera, dotyczyły one najczęściej przewodu pokarmowego (71% pacjentów), a w następnej kolejności odpowiednio: jamy ustnej (28,5%), układu oddechowego (28,5%) oraz warg (14%), skóry (14%) i oczu (14%) (tab. II). W przypadku objawów ze strony przewodu pokarmowego najczęściej stwierdzano nudności (43%) oraz zgagę (28,5%) (tab. III).

U pacjentów nietolerujących marchwi objawy niepożądane dotyczyły najczęściej (podobnie jak w przypadku jabłka) jamy ustnej (78% pacjentów) i układu oddechowego (55,5%), a następnie przewodu pokarmowego (44%), warg i oczu (po 33%). Najmniej objawów niepożądanych dotyczyło skóry (22%) (tab. II). Jeżeli chodzi o zgłaszane dolegliwości ze strony jamy ustnej, również – jak w przypadku jabłka – dotyczyły one najczęściej świądu (33%), obrzęku (33%) oraz pieczenia (22%) (tab. III).

Dodatni wynik testów skórnych prick z alergenem brzozy dotyczył wszystkich uczestników badania, przy czym za wynik dodatni (zarówno dla brzozy, jak i dla pozostałych alergenów pokarmowych) uważano bąbel większy lub równy bąblowi histaminy.

Dodatni wynik testów skórnych z alergenami jabłka stwierdzono u 1 z 17 pacjentów zgłaszających objawy niepożądane po spożyciu tego pokarmu, u 4 pacjentów z 7 po spożyciu selera oraz u 2 z 9 po spożyciu marchwi.

W testach Prick by Prick z użyciem natywnych alergenów wyniki przedstawiały się następująco: dodatni wynik uzyskano u 12 pacjentów z 17 zgłaszających objawy niepożądane po spożyciu jabłka, u 4 pacjentów z 7 po spożyciu selera oraz u 5 z 9 po spożyciu marchwi.

Średni poziom całkowitej IgE u wszystkich 19 badanych wynosił 239,1 kU/l. Poziom swoistej IgE dla brzozy dla wszystkich 19 pacjentów wynosił 5,8 kU/l, natomiast poziom IgE dla jabłka, selera oraz marchwi wynosił odpowiednio: 0,62 kU/l; 0,99 kU/l oraz 1,44 kU/l. U wszystkich badanych pacjentów wykazano obecność alergenowi swoistych przeciwciał IgE przeciw alergenowi brzozy rBet v 1.

Jedynie u 3 pacjentów wykazano obecność białka przeciwko alergenowi brzozy o masie cząsteczkowej 17–18 kDa, które odpowiada głównemu alergenowi brzozy Bet v1.

Natomiast tylko u 1 osoby wykazano obecność przeciwciał reagujących jednocześnie z białkami jabłka, selera i marchwi o tej samej masie cząsteczkowej, co odpowiada głównym alergenom tych pokarmów – Mal d 1, Api g 1 oraz Dau c1.

DYSKUSJA

Głównym alergenem brzozy jest białko Bet v 1 należące do większej rodziny białek PR-10, tzw. białek zależnych od patogenezy (PRP – „pathogenesis-related proteins”), których produkcja wzbudzana jest w odpowiedzi na infekcje (bakteryjne, wirusowe, grzybicze), uszkodzenie, czy działanie innych czynników, takich jak: susza, wilgoć, niska temperatura, ozon, czy promieniowanie UVB. Do białek homologicznych z Bet v 1 zaliczamy szereg alergenów pochodzących z innych źródeł, np. selera (Api g 1), jabłka (Mal d 1) i marchwi (Dau c 1), olchy (Aln g 1) i leszczyny (Cor a 1). Rośliny charakteryzujące się dużą ekspresją tych białek są bardziej odporne na działanie niekorzystnych czynników, co jednocześnie zwiększa ich alergenność. Alergeny te nie są odporne na trawienie przez enzymy przewodu pokarmowego oraz denaturację (np. w czasie obróbki termicznej). Dlatego też u osób uczulonych na te białka objawy występują najczęściej jedynie po spożyciu ich surowych postaci i dotyczą głównie błony śluzowej jamy ustnej [5, 6], co potwierdziły również przedstawiane przez autorów badania.

Najczęstszym i najlepiej scharakteryzowanym zjawiskiem jest współistnienie alergii na pyłek brzozy z nietolerancją na alergen jabłka [7]. Rzadziej spotyka się zespół alergii brzoza–marchew oraz brzoza–seler. Zmniejszona częstość występowania objawów niepożądanych po spożyciu selera wydaje się wynikać z nawyków żywieniowych pacjentów, którzy rzadko decydują się na spożycie surowej postaci tego pokarmu. Częściej objawy niepożądane (w badaniach autora dotyczyły one najczęściej przewodu pokarmowego) wynikają z przypadkowego spożycia, m.in. w postaci przetworzonej jako składnik mieszanek przypraw. W przypadku spożycia selera częściej pojawiają się również ciężkie objawy niepożądane, takie jak wstrząs anafilaktyczny (z aktualnych badań wykluczono 3 takie osoby) [8].

Do wykonania testów skórnych prick użyto gotowych wyciągów alergenowych (Allergopharma). Są to wyciągi standaryzowane w każdej profesjonalnej wytwórni – standaryzacja odbywa się przez odniesienie do tzw. wewnętrznego wzorca, który jest szeregiem białkowych prążków widocznych podczas elektroimmunoforezy. Dzisiejsze wzorce powstały przed wykryciem polialergenów, panalergenów i ich izoform i stanowią nieokreśloną do końca biochemicznie mieszaninę antygenów, np. białek pyłku wielu traw i zbóż. Niezależnie od tego, jak dokładnie ustalono wzorzec, np. z uwzględnieniem odrębności traw na różnych terenach, może on nie zawierać ważnych determinant krzyżowych dla wielu gatunków traw i zbóż. Wciąż pozostaje nieporównywalny (ściślej nie w pełni porównywalny) skład białkowy między producentami z różnych krajów. Wystarczy, że zawiera nieco inne aminokwasy albo antygeny o odmiennej konfiguracji przestrzennej. Użycie gotowych wyciągów alergenowych może dawać wyniki fałszywie ujemne ze względu na fakt, że w procesie przygotowywania, produkcji, standaryzacji, konfekcjonowania i przechowywania wiele alergenów ulega degradacji, a ich właściwości immunologiczne osłabieniu. [9]. Dlatego też bardziej celowe wydaje się użycie do testów skórnych alergenów natywnych ( ze świeżych owoców i warzyw), co potwierdzili nie tylko autorzy pracy, ale również Osterballe i współpracownicy [10].

Wielu autorów podkreśla również brak korelacji objawów klinicznych z poziomem całkowitego i swoistych IgE [7, 11]. Przyczyną fałszywie ujemnych wyników może być fakt wchodzenia IgE w kompleksy immunologiczne z przeciwciałami anty-IgE, czy lokalizacja przeciwciał IgE w tzw. narządzie wstrząsowym (skóra, śluzówka układu oddechowego, pokarmowego, itp.) i opłaszczenie komórek tucznych. Sytuacje te są przyczyną niskiego stężenia IgE w surowicy krwi, mimo obecności aktywnego procesu alergicznego [12]. W badaniach przeprowadzonych przez Hoffmann-Sommergruber K. i wsp. jedynie 42% pacjentów uczulonych na seler wykazywało podwyższony poziom swoistego IgE [8]. Znaczenie może mieć również czas od wystąpienia objawów alergii do czasu pobrania próbki krwi do oznaczenia badania. Często zdarza się bowiem tak, że pacjent oczekuje w kolejce do specjalisty, a okres półtrwania IgE jest stosunkowo krótki i wynosi około 2–3 doby.

Immunoblotting polega na rozdzieleniu mieszaniny białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z siarczanem dodecylu sodu (SDS-PAGE), przeniesieniu ich na membranę (elektrotransfer) i identyfikacji związanego badanego białka za pomocą specyficznych dla niego przeciwciał. Powstałe kompleksy antygen–przeciwciało wykrywane są przy użyciu kolejnych przeciwciał (rozpoznających fragment Fc specyficznych przeciwciał), sprzężonych z enzymem katalizującym reakcję z barwnym, nierozpuszczalnym produktem. W efekcie na błonie, w miejscu gdzie znajduje się badane białko, pojawia się barwny prążek [13]. Metoda ta jest nie tylko bardzo kosztowna, ale i pracochłonna, stąd jej powszechne zastosowanie w rutynowej diagnostyce alergologicznej nie jest możliwe. Ograniczeniem metody jest również wrażliwość niektórych antygenów białkowych (epitopów konformacyjnych) na proces denaturacji. Wyniki fałszywie ujemne mogą wynikać z obecności wielu izoform danych alergenów, które różnią się zdolnością wiązania IgE [14]. Ważny jest również fakt, że ujemny wynik tej metody nie jest podstawą do wykluczenia alergii krzyżowych.

WNIOSKI

U pacjentów uczulonych na pyłek brzozy współistniejąca alergia pokarmowa dotyczyła najczęściej jabłka, w mniejszym stopniu marchwi i selera.

Objawy niepożądane po spożyciu jabłka oraz marchwi dotyczyły najczęściej jamy ustnej i obejmowały: świąd, obrzęk oraz uczucie pieczenia. Natomiast objawy niepożądane po spożyciu selera lokalizowały się głównie w przewodzie pokarmowym.

Spożycie jabłka oraz marchwi wiąże się najczęściej z wystąpieniem łagodnych objawów niepożądanych, natomiast u osób uczulonych na seler występują cięższe objawy, włączając w to napad astmy oraz wstrząs anafilaktyczny.

Zarówno wynik testów skórnych, jak i oznaczenie poziomu całkowitej oraz swoistych IgE, nie może stanowić kryterium rozpoznania lub wykluczenia alergii. Zastosowanie testów skórnych z użyciem natywnych alergenów wydaje się być właściwszą metodą w diagnostyce alergii pokarmowej, w porównaniu do testów skórnych typu prick z gotowymi ekstraktami alergenów.

Pomimo że immunoblotting jest dobrym sposobem na potwierdzenie istnienia reakcji krzyżowych, nadal pozostaje metodą weryfikującą i uzupełniającą inne testy diagnostyczne, a ujemny wynik tej próby nie wyklucza występowania tego rodzaju alergii.

Pomimo istnienia wielu metod diagnostycznych, prawidłowo zebrany wywiad i badanie przedmiotowe nadal stanowią podstawę prawidłowego rozpoznania alergii.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Cudowska B.: Reakcje krzyżowe a nadwrażliwość pokarmowa. W: Alergia na pokarmy. Bartuzi Z. (red.) Mediton, Łódź 2006: 59-68.

2.    Buczyłko K., Budkowska H., Wosztak H.: Znaczenie kliniczne wybranych epitopów pyłku drzew. Alergia 2004; 4 (22): 8-13.

3.    Romański B., Bartuzi Z.: Alergia i nietolerancja pokarmów u osób dorosłych: Alergia skrzyżowana. W: Alergia i nietolerancja pokarmów. Problem społeczny i lekarski współczesnej cywilizacji. Romański B., Bartuzi Z. (red.) Wydawnictwo Śląsk, 2004: 311-330.

4.    Cudowska B., Kaczmarski M.: Alergiczne reakcje krzyżowe - aspekty kliniczne i diagnostyczne. Alergia 2003; 2 (17): 41-45.

5.    Ferreira F. i wsp.: Allergic cross-reactivity: from gene to the clinic. Allergy 2004; 59: 243-267.

6.    Marzban G. i wsp.: Fruit cross-reactive allergens: A theme of uprising interest for consumers’ health. Biofactors 2005; 23 (4): 235-241.

7.    Hoffmann-Sommergruber K. i wsp.: Molecular characterization of Dau c 1, the Bet v 1 homologous protein from carrot and its cross-reactivity with Bet v 1 and Api g 1. Clin Exp Allergy 1999; 29: 840-847.

8.    Hoffmann-Sommergruber K. i wsp.: Characterization of Api g 1.0201, a New Member of the Api g 1 Family of Celery Allergens. Int Arch Allergy Immunol 2000; 122: 115-123.

9.    Buczyłko K., Budkowska H.: Alergia pokarmowa a uczulenie na pyłek roślin. Diagnostyka i postępowanie. Terapia 2005; 4 (165): 22-25.

10.    Osterballe M. i wsp.:  Diagnostic value of scratch-chamber test, skin prick test, histamine release and specific IgE in birch-allergic patients with oral allergy syndrome to apple. Allergy 2003; 58 (9): 950-953.

11.    Ballmer-Weber B.K. i wsp.: Component-resolved in vitro diagnosis in carrot allergy: Does the use of recombinant carrot allergens improve the reliability of the diagnostic procedure? Clin Exp Allergy 2005; 35 (7): 970-978.

12.    Wasilewska J., Cudowska B., Kaczmarski M.: Objawy kliniczne alergii. Trudności diagnostyczne u dzieci z nadwrażliwością pokarmową. Alergia 2001/2002; 4 (11): 32-37.

13.    Brewczyński P. Z., Zawisza E.: Wybrane aspekty standaryzacji wyciągów alergenowych (część II). Alergia 2004; 4 (22): 55-59.

14.    Son D.Y. i wsp.: Pollen-related food allergy: cloning and immunological analysis of isoforms and mutants of Mal d 1, the major apple allergen, and Bet v 1, the major birch pollen allergen. Eur J  Nutr 1999; 38: 201-215.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Katarzyna Napiórkowska

Katedra i Klinika Alergologii, Immunologii Klinicznej i Chorób Wewnętrznych Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
SPZOZ Szpital Wojewódzki im. dr J. Biziela
ul. Ujejskiego 75, 85-168 Bydgoszcz tel./fax: +48 52 365 54 16
e-mail: kikalerg@cm.umk.pl

Pracę nadesłano: 13.04.2009 r.
Przyjęto do druku: 15.05.2009 r.