WSTĘP

Badanie substancji zawartych w kondensacie powietrza wydychanego opiera się na założeniu, że skład powietrza wydychanego odpowiada składowi płynu na powierzchni oskrzeli i pęcherzyków płucnych. Przy tym założeniu uzasadnionym wydaje się oznaczanie substancji przechodzących do powietrza wydychanego. Jest to możliwe poprzez oziębienie powietrza wydychanego, prowadzące w efekcie do kondensacji substancji będących w fazie gazowej i przejście ich w fazę ciekłą. Kondensatem powietrza wydychanego określa się wszystkie składniki powietrza wydychanego precypitujące i kondensujące w temperaturze od 0 do minus 100C.

Substancje przechodzące z powierzchni nabłonka dróg oddechowych i pęcherzyków płucnych do powietrza wydychanego podzielono na trzy grupy: substancje lotne (woda, nadtlenek wodoru - H2O2, większa część lotnych składników organicznych), substancje słabolotne (leukotrieny, 8-izoprostany) i substancje nielotne (białka, sole mineralne) [1].

W skład kondensatu powietrza wydychanego wchodzą substancje uwalniane z powierzchni: górnych dróg oddechowych (jama ustno-gardłowa, tchawica), dolnych dróg oddechowych (oskrzela, oskrzeliki) i płuc.

Przy oddychaniu objętością oddechową energia przepływu laminarnego jest bardzo mała i niewystarczająca do powstania aerozolu, co eliminuje z kondensatu składniki górnych dróg oddechowych. Oddychanie przez ustnik wyposażony w zastawkę oddzielającą powietrze wydychane od wdychanego i kierujący strumień powietrza przez kondensator oziębiony do temperatury -100C, pozwala na skroplenie i zamrożenie w ciągu 10–15 minut oddychania od 1 do 3 ml kondensatu [2].

Tlenek azotu jest substancją biologicznie czynną. W organizmie zwierząt powstaje w następstwie przemiany (oksydacji) L-argininy w L-cytrulinę katalizowanej przez enzym cytoplazmatyczny – syntazę tlenku azotu. Opisano trzy izoformy syntazy tlenku azotu. Określono również lokalizacje genów odpowiedzialnych za ich wytwarzanie. Syntaza NO I określana jako izoforma neuronalna (nNOS) jest obecna w neuronach wchodzących w skład unerwienia układu oddechowego oraz komórkach mięśni gładkich oskrzeli. Powstający w efekcie jej działania NO pełni funkcję przekaźnika nerwowego oraz regulatora mięśni gładkich. Gen odpowiedzialny za syntezę nNOS zlokalizowany jest na chromosomie 7. Syntaza NO III - izoforma endotelialna (eNOS) występuje w komórkach śródbłonka naczyń układu krążenia a powstający tam NO odpowiedzialny jest za regulację napięcia mięśni gładkich naczyń i ciśnienie tętnicze krwi. Gen odpowiedzialny za produkcję eNOS zlokalizowany jest na chromosomie 17.

Obie syntazy (nNOS i eNOS) są obecne na stałe w komórkach w stanie fizjologii, natomiast syntaza NO II – izoforma indukowana (iNOS) ulega ekspresji w różnych komórkach po ich kontakcie z cytokinami lub endotoksynami, uczestnicząc w procesach zapalnych oraz w odpowiedzi na zakażenie. Gen odpowiedzialny za wytwarzanie (iNOS) zlokalizowany jest na chromosomie 12. Wykazano u ludzi wzrost stężenia iNOS na powierzchni komórek nabłonka układu oddechowego, komórek śródbłonka naczyń, komórek mięśni gładkich i makrofagów po kontakcie z uczulającym alergenem, ekspozycji na zanieczyszczenia atmosferyczne, pod wpływem bakteryjnych lipopolisacharydów, TNF-alfa, IL-1beta, INF–gamma [3, 4, 5, 6, 7].

Zbieranie kondensatu powietrza wydychanego można uznać za nieinwazyjną metodę uzyskiwania i badania wydzieliny z układu oddechowego. Metoda ta pozwala z jednej próbki kondensatu oznaczyć wiele parametrów (stężenie cytokin prozapalnych, nadtlenku wodoru, jonów itp.), co może być bardzo istotne w ocenie procesu zapalnego w drogach oddechowych u dzieci z astmą [8, 9, 10, 11, 12].

Celem pracy była próba odpowiedzi na pytanie, czy oznaczanie NO i IL-4 w kondensacie powietrza wydychanego może mieć zastosowanie w ocenie zaostrzeń astmy u dzieci?

MATERIAŁ I METODY

Badania wykonano u 31 dzieci z rozpoznaną astmą. W badanej grupie było 16 dziewcząt i 15 chłopców w wieku od 8 do 18 lat (średnia wieku 13,3 lat, SD-3,2). Chorych podzielono na trzy grupy. Do pierwszej zakwalifikowano 7 dzieci w okresie zaostrzenia astmy, do drugiej - 9 dzieci bez klinicznych i spirometrycznych objawów obturacji, przyjmujących glikokortykosteroidy i β2-mimetyki wziewnie dłużej niż 7 dni, a do trzeciej grupy zakwalifikowano 15 dzieci bez klinicznych i spirometrycznych cech obturacji, które od ponad 3 miesięcy nie otrzymywały żadnych leków. Grupę kontrolną stanowiło 15 zdrowych dzieci w wieku od 11 do 17 lat.

Kondensat powietrza wydychanego zbierano przez 15 min spokojnego oddychania z wykorzystaniem urządzenia EcoScreen firmy Jaeger. Otrzymane próbki kondensatu natychmiast zamrażano do temp -700C. Wartości NO i IL-4 oznaczano metodą ELISA w Zakładzie Ochrony Mikrofalowej Wojskowego Instytutu Higieny i Epidemiologii.

WYNIKI

Najwyższe stężenie tlenku azotu uzyskano w grupie dzieci z zaostrzeniem astmy i wynosiło ono średnio 9,3 µmol/ml. Wartości mieściły się o przedziale od 5,1 do 14,1 µmol/ml z SD=2,96 i różniły się znamiennie statystycznie p<0,0001 w stosunku do wartości uzyskanej u dzieci z astmą bez zaostrzenia, ale przyjmujących leki (grupa druga), gdzie stężenie NO wynosiło średnio 3,38 µmol/ml w przedziale od 2,57 do 5,10 µmol/ml, SD=1,06. U dzieci zakwalifikowanych do grupy trzeciej wartości NO mieściły się w przedziale od 1,4 do 4,2 µmol/ml. Średnia wartość NO w tej grupie wynosiła 2,42 µmol/ml, SD=0,72. W grupie dzieci zdrowych wartość stężenia NO w kondensacie powietrza wydychanego była najniższa i mieściła się w przedziale od 0,12 do 1,78 µmol/ml, średnio 0,65 µmol/ml, SD=0,49 (tab. I-V).

Stężenie IL-4 w kondensacie powietrza wydychanego było najwyższe w grupie dzieci z objawami zaostrzenia astmy i wynosiło od 37,0 do 56,1 pg/ml, średnio 51 pg/ml, SD-6,7. W grupie dzieci leczonych, bez zaostrzenia średnia wartość IL-4 w kondensacie powietrza wydychanego wynosiła 41 pg/ml, SD-7,2; różnica była w tych grupach znamienna statystycznie. Wartości średnie IL-4 w grupie trzeciej – dzieci bez objawów i bez leków, były najniższe wśród dzieci z rozpoznaniem astmy, wynosiły 37,11 pg/ml, SD-4,3. U dzieci z grupy kontrolnej wartość stężenia IL-4 wynosiła 32,85 pg/ml, SD-5,5 i była najniższa we wszystkich badanych grupach.

DYSKUSJA

Wyniki badań własnych przedstawione w pracy wskazują, iż stężenie NO i cytokin prozapalnych zależy od stopnia nacieku zapalnego w błonie śluzowej oskrzeli. Uzyskane wartości stężeń NO i IL-4 w grupie dzieci z klinicznymi i spirometrycznymi wykładnikami obturacji były najwyższe wśród ocenianych grup a różnice pomiędzy tymi wartościami były znamienne statystycznie. Różnice wartości stężeń NO i IL-4 w grupie drugiej (dzieci bez objawów obturacji leczone glikokortykosteroidami i β2-mimetykami podawanymi drogą wziewną) i grupie trzeciej (dzieci bez objawów choroby, które nie były leczone od ponad 3 miesięcy) nie były już tak znaczące a wartości stężeń NO w kondensacie powietrza wydychanego pomiędzy tymi grupami były nieznamienne statystycznie p<0,01. Najniższe wartości stężeń tlenku azotu i IL-4 stwierdzono u dzieci zdrowych nie obciążonych astmą w wywiadzie (grupa kontrolna) a różnice te w stosunku do wszystkich pozostałych ocenianych grup były znamienne statystycznie. Oznaczanie tych substancji w kondensacie powietrza wydychanego jest metodą nieinwazyjną i daje możliwość wielokrotnych powtórzeń.

Uzyskane wyniki badań NO i IL-4 wskazują, że wartości stężeń w kondensacie powietrza wydychanego zależą od stanu klinicznego i wskaźników badania spirometrycznego.

Podobne obserwacje przedstawili Panagou i wsp. opisując wzrost stężenia NO w powietrzu wydychanym u 29 chorych w wieku 18-45 lat z łagodną i umiarkowaną astmą, odnosząc wyniki do wartości uzyskanych w 20-osobowej grupie kontrolnej osób zdrowych, będących w tym samym przedziale wieku [8].

Linkosalo i wsp. badając 82 dzieci z atopią w wieku od 7 do 21 lat wykazali zależność stężenia NO i leukotrienów cysteinowych w powietrzu wydychanym od intensywności toczącego się zapalenia eozynofilowego dróg oddechowych [11].

Straub i wsp. badając 30 dzieci z astmą w wieku 2 do 5 lat wykazali znamienne statystycznie obniżenie się stężenia NO w powietrzu wydychanym po 4-tygodniowym leczeniu montelukastem w dawce 4 mg/dobę. Różnica stężeń była znamienna statystycznie i korelowała z poprawą stanu klinicznego [4].

Obok powszechnie uznanego tlenku azotu jako mediatora procesu zapalnego, trwają badania poszukujące możliwości wykorzystania innych markerów dla monitorowania aktywności procesu zapalnego u chorych z astmą z wykorzystaniem kondensatu powietrza wydychanego.

Obok cytokin prozapalnych uwalnianych z aktywowanych leukocytów naciekających ścianę oskrzeli w astmie, uwalniane są reaktywne formy tlenu (nadtlenek wodoru H2O2, rodnik hydroksylowy OHo, tlen syngletowy), które uszkadzają nabłonek oddechowy nasilając proces zapalny. Wykazano wzrost stężenia H2O2 w kondensacie powietrza wydychanego u dzieci z astmą, w porównaniu do grupy dzieci zdrowych. Różnice były statystycznie znamienne również pomiędzy grupami badanych dzieci o różnym stopniu ciężkości astmy. Badaniem tym wykazano zależność stężenia H2O2 w kondensacie powietrza wydychanego od stopnia ciężkości astmy u dzieci oraz przydatność oznaczania H2O2 w kondensacie powietrza wydychanego (jako badania nieinwazyjnego) dla oceny aktywności procesu zapalnego w drogach oddechowych u tych chorych [13].

W badaniu Nicolaiu i wsp. obejmującym łącznie grupę 809 dzieci oznaczano pH kondensatu powietrza wydychanego wychodząc z założenia, że w procesie zapalnym dochodzi do zmiany pH. Otrzymane wartości pH kondensatu powietrza wydychanego różniły się znacząco (od 4,40 do 8,29) u poszczególnych badanych dzieci. Jednak w badaniu tym nie wykazano korelacji pomiędzy zmianą pH a objawami klinicznymi astmy, ilością zużywanych leków, intensywnością procesu zapalnego mierzonego stężeniem wydychanego tlenku azotu, czy funkcją płuc ocenianą w badaniu spirometrycznym lub pletyzmograficznym. Nie wykazano również istotnych różnic pomiędzy pH u dzieci zdrowych i dzieci z rozpoznaną astmą. Autorzy tłumaczą tak dużą rozpiętość wartości pH kondensatu powietrza wydychanego właściwościami osobniczymi [14].

Postęp w rozwoju metod laboratoryjnych pozwolił na odkrycie i oznaczenie około 200 substancji w ludzkim powietrzu wydechowym. Identyfikacja substancji z grupy lotnych jest możliwa przy użyciu chromatografii gazowej, spektrofotometrii masowej. Wydychane mediatory lub produkty metabolizmu mogą być oznaczane metodami enzymatycznymi lub radioimmunologicznymi.

W kondensacie powietrza wydychanego można więc oznaczyć leukotrieny, prostaglandyny, markery nowotworowe, przeciwciała, hormony tkankowe, cytokiny i ich receptory. Mediatory te znajdują się w płynie pokrywającym drogi oddechowe i pęcherzyki płucne, dostarczają szczególnie ważnych informacji dla poznania procesów patologicznych i postawienia rozpoznania wielu chorób układu oddechowego [12].

WNIOSKI

1. Wartości stężeń NO i IL-4 w kondensacie powietrza wydychanego są podwyższone u pacjentów z astmą niezależnie od stopnia kontroli choroby.

2. Stężenie NO i IL-4 w kondensacie powietrza wydychanego koreluje ze stanem klinicznym dzieci z astmą.

3. Oznaczanie stężeń NO i IL-4 w kondensacie powietrza wydychanego może być przydatne w ocenie kontroli astmy.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Baraldi E., Ghiro L., Piovan V. i wsp.: Safety and success of exhaled breath condensate collection in asthma. Archives of Disease in Childhood 2003; 88: 358-360.

2.    Rothe M.: Breath condensate measurements. Info Jaeger 1st edition, April 2001, 13-14.

3.    Ziora D., Polońska A., Kałuska K. i wsp.: Stężenie tlenku azotu w powietrzu wydechowym (eNO) u chorych na sarkoidozę. Pneumonologia i Alergologia Polska 2002; 5-6: 290-295.

4.    Ziętkowski Z., Bodzenta-Łukaszyk A.: Tlenek azotu w diagnostyce alergologicznej. Polskie Archiwum Medycyny Wewnętrznej 2003; CX, 2 (8): 925-931.

5.    Ziętkowski Z., Bodzenta-Łukaszyk A.: Rola tlenku azotu w astmie oskrzelowej. Pol Merk Lek 2002; XII, 72: 519-521.

6.    Kałuska K., Ziora D.: Tlenek azotu w powietrzu wydechowym (eNO) w różnych chorobach układu oddechowego. Pneumonologia i Alergologia Polska 2002; 9-10: 509-517.

7.    Straub D.A., Minocchieri S., Moeller A. i wsp.: The effect of montelukast on exhaled nitric oxide and lung function in asthmatic children 2 to 5 years old. Chest 2005; 127: 509-514.

8.    Panagou P., Papatheodorou G., Loukides S. i wsp.: Breath condensate total nitrate - nitrite levels in pathiens with asthma. Europen Respiratory Society Madrid Spain 1999 October 9-13; P-3116.

9.    Scheideler L., Manke H., Schwulera U. i wsp.: Detection of Nonvolatile macromolecules in Breath. A Possible Diagnostic Tool? American Review of Respiratory Disease 1993; 148: 778-784.

10.    Reinhold P., Langenberg A., Becher G. i wsp.: Breath condensate – a medium obtained by a noninvasive method for the detection of inflammation mediators of the lung. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 1999; 112 (6-7): 254-259.

11.    Linkosalo L., Holm K., Kaila M. i wsp.: Exhaled Bronchial NO and cysteinyl-leukotrienes in breath condensate in atopic children. 12th ERS Annual Congress 14-18 September 2002 Stockholm Sweden [2633].

12.    Montuschi P., Corradi M., Ciabattoni G. i wsp.: Increased 8-Isoprostane, a Marker of Oxidative Stress in Exhaled Condensate of Asthma Patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 1999; 160: 216-220.

13.    Doniec Z.: Badanie nadtlenku wodoru (H2O2) w kondensacie powietrza wydechowego – nowa, nieinwazyjna metoda biochemicznej oceny aktywności procesu zapalnego w astmie oskrzelowej u dzieci. Acta Pneumonologica et Allergologica Pediatrica 2002; 5, 4: 3-7.

14.    Nicolaou N.C., Lowe L.A., Murray C.S., Woodcock A., Simpson A., Custovic A.: Exhaled Breath Condensate pH Childhood Asthma Unselected Birth Cohort Study. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2006; 174: 254-259.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Bolesław Kalicki
Klinika Pediatrii, Nefrologii
i Alergologii Dziecięcej WIM
00-909 Warszawa, ul. Szaserów 128

Pracę nadesłano: 18.09.2008 r.
Przyjęto do druku: 23.10.2008 r.