Praca była finansowana ze środków statutowych Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku  (P-06622P).

WSTĘP

Limfocyty T, wspólnie z  eozynofilami i makrofagami, pełnią istotną rolę w regulacji zapalenia alergicznego leżącego u podstawy astmy. Wykazano, że najliczniej reprezentowaną grupą limfocytów T zlokalizowanych w drogach oddechowych pacjentów z astmą są limfocyty o fenotypie Th2 [1]. Ponadto, w odróżnieniu od osób zdrowych, fenotyp limfocytów T zlokalizowanych w oskrzelach pacjentów z astmą wskazuje na ich aktywację. Limfocyty T w oskrzelach pacjentów z astmą charakteryzują się wzmożoną ekspresją takich wskaźników aktywacji jak CD25 i CD69 [2, 3]. Ponadto, na ich powierzchni wykryto zwiększoną ekspresję cząstek adhezyjnych takich jak ICAM-1 czy CD103 [3].

Fenotyp limfocytów T determinowany jest zarówno ich aktualnie pełnioną funkcją, jak też potencjalną zdolnością do odbierania sygnałów przekazywanych przez inne komórki, chemokiny czy cytokiny. Dotychczasowe badania z zastosowaniem płukania oskrzelikowo-pęcherzykowego (BAL) czy indukcji plwociny wykazały, że w drogach oddechowych pacjentów z astmą występują podwyższone poziomy cytokin nasilających alergiczny proces zapalny, przede wszystkim IL-4, IL-13 [4-6].

Wykazano również, że komórki immunologiczne dróg oddechowych charakteryzują się obecnością receptorów dla tych cytokin. Znacznie mniej wiadomo jednak o ekspresji receptorów dla innych pro- i przeciwalergicznych cytokin występujących w wykrywalnych stężeniach u pacjentów z astmą. Analiza stężeń cytokin w BAL i plwocinie indukowanej pacjentów z astmą wykazała porównywalne z osobami zdrowymi bądź podwyższone poziomy przeciwalergicznej IL-10 [7-9]. Dotychczas nie określono jednak, czy zależna od ekspresji receptora IL-10R zdolność odpowiedzi na immunosupresyjne sygnały przekazywane za pośrednictwem IL-10 nie jest obniżona w astmie. Nie wykazano również, czy stwierdzony ostatnio związek niektórych polimorfizmów genów dla receptora dla IL-7 z rozwojem astmy znajduje odzwierciedlenie w poziomie ekspresji tego receptora na powierzchni limfocytów T [10].

W naszych dotychczasowych pracach wykazaliśmy wysoką ekspresję receptora IL-10R i niską – IL-7R na powierzchni makrofagów uzyskanych metodą indukcji plwociny [11]. Celem niniejszej pracy była ocena ekspresji receptorów dla IL-10 i IL-7 na powierzchni limfocytów T w plwocinie indukowanej pacjentów z astmą.

MATERIAŁ I METODY

Do badania zakwalifikowano 13 niepalących pacjentów z astmą umiarkowaną (sześciu leczonych dotychczas tylko LABA oraz siedmiu otrzymujących oprócz LABA wziewne GKS w dawce równoważnej 400–800 µg budezonidu). Wskaźnik FEV1 w grupach pacjentów wynosił odpowiednio 74,6% oraz 86,1%. Do grupy kontrolnej zakwalifikowano siedem zdrowych, niepalących osób.

Indukcja i badanie plwociny odbywały się zgodnie z opisanym wcześniej protokołem [11]. Stężenie tlenku azotu w powietrzu wydychanym było oceniane zgodnie z protokołem opisanym we wcześniejszych badaniach [11]. Badanie ekspresji receptorów powierzchniowych limfocytów T plwociny indukowanej przeprowadzono metodą cytometrii przepływowej (FACSCalibur, BD Biosciences) w sposób opisany w poprzednich opracowaniach [12, 13]. Do oceny użyto przeciwciał monoklonalnych anty-CD3FITC, anty-CD210 PE (receptor dla IL-10) i anty-CD127PE (receptor dla TSLP i IL-7) wyprodukowanych przez BD Biosciences. W analizie statystycznej wykorzystano testy U Manna-Whitney’a dla poszczególnych grup oraz test korelacji rang Spearmana, przyjmując wartość p < 0,05 za istotną statystycznie.

WYNIKI

Limfocyty CD3+ stanowiły 1,8% (0,9%-2,6%) żywotnych komórek w plwocinie u pacjentów z astmą nieleczonych GKS, 1,4% (0,8%-2,2%) – u pacjentów z astmą otrzymujących wziewne GKS oraz 1,6% (0,8%-2,3%) u osób zdrowych.

Nie wykazano istotnych statystycznie różnic w ekspresji antygenu CD210 (receptora dla IL-10) na powierzchni limfocytów T w plwocinie indukowanej pomiędzy badanymi grupami pacjentów. Średnia intensywność fluorescencji (MFI) antygenu CD210 na powierzchni limfocytów T u pacjentów z astmą bez GKS wynosiła 1,34 (IQR, 0,96), u pacjentów z astmą leczonych GKS – 1,445 (IQR, 1,14), u osób zdrowych – 1,21 (IQR, 1,88). Poziomy ekspresji IL-10R we wszystkich grupach badanych były znamiennie wyższe od ekspresji receptora CD127. Średnia intensywność fluorescencji antygenu CD127 u pacjentów z astmą nieleczonych GKS wynosiła 0,41 (IQR, 0,75), była nieistotnie statystycznie wyższa niż u pacjentów z astmą leczonych GKS – 0,09 (IQR, 0,23); u osób zdrowych wynosiła – 0,28 (IQR, 0,32).

Dalsze badania nie wykazały wzajemnej korelacji pomiędzy ekspresją CD210 a CD127 na powierzchni oskrzelowych limfocytów T (R=-0,195, P=0,556). Nie ujawniono również korelacji pomiędzy intensywnością zapalenia alergicznego w drogach oddechowych pacjentów z astmą mierzoną za pomocą pomiaru tlenku azotu w powietrzu wydychanym a ekspresją CD210 (R=0,292, P=0,281) i CD127 (R=-0,357, P=0,388).

DYSKUSJA

W przeprowadzonym badaniu oceniono poziom ekspresji receptorów dla IL-10 i IL-7 na powierzchni limfocytów T u pacjentów z astmą leczonych lub nieleczonych wziewnymi GKS. Wykazaliśmy, że limfocyty T w plwocinie indukowanej posiadają widoczną ekspresję receptora IL-10R, kilkukrotnie wyższą niż receptora IL-7R. Poziom ekspresji receptora dla IL-10 na powierzchni limfocytów T w plwocinie indukowanej jest jednak znamiennie niższy niż na powierzchni limfocytów T krwi obwodowej (badania własne). Interesujący jest również fakt, że uzyskane obecnie obserwacje dotyczące limfocytów T są zbieżne z wynikami uzyskanymi wcześniej podczas oceny fenotypu makrofagów oskrzelowych. Może to sugerować podobny, wspólny dla wszystkich komórek zapalnych, mechanizm regulacji odpowiedzi na działanie IL-10 i IL-7. Z drugiej jednak strony, zmiany ekspresji receptorów dla tych cytokin na powierzchni limfocytów T należy rozpatrywać w kontekście zróżnicowanego poziomu ekspresji tych receptorów na różnych subpopulacjach limfocytów T. Najwyższą ekspresję receptora dla IL-10 obserwujemy na limfocytach z wysoką ekspresją CD25, a więc o fenotypie aktywowanym lub regulatorowym [Moniuszko i wsp., manuskrypt w przygotowaniu]. Przeciwnie, wysokie poziomy receptora dla IL-7 znajdujemy na powierzchni limfocytów dziewiczych i pamięci, ale nie „świeżo” aktywowanych limfocytów efektorowych [14, 15].

W świetle powyższych faktów możemy wnioskować, że w drogach oddechowych pacjentów z astmą zlokalizowane są głównie limfocyty aktywowane wywodzące się z subpopulacji limfocytów efektorowych. Co ciekawe, wniosek ten jest zgodny z naszymi wcześniejszymi badaniami u naczelnych zakażonych wirusem SIV: w ich płucach występowały głównie limfocyty z bardzo niską ekspresją receptora dla IL-7 charakterystyczną dla limfocytów efektorowych [14].

Interesujące jest wykazanie braku różnic ekspresji receptora dla IL-10 na powierzchni limfocytów T pomiędzy pacjentami z astmą leczoną i nieleczoną wziewnymi GKS a osobami zdrowymi. W świetle obecnych wyników trudno ustalić, czy fakt ten może odpowiadać za brak pełnego zahamowania alergicznej reakcji zapalnej pomimo utrzymującej się obecności IL-10 w drogach oddechowych astmatyków. Z drugiej strony, powyższe obserwacje mogą stać się impulsem do powstania tych rozwiązań terapeutycznych, które poprzez zwiększenie ekspresji IL-10R, mogłyby doprowadzić do większej wrażliwości komórek zapalnych na efekty działania IL-10. Jak wynika z naszych dotychczasowych badań, wziewne GKS, pomimo swej niekwestionowanej roli w hamowaniu zapalenia alergicznego, nie są w stanie doprowadzić do wzrostu ekspresji receptora dla IL-10 na powierzchni oskrzelowych limfocytów T i makrofagów [11]. Tym niemniej, zauważona przez nas tendencja do utrzymywania się zmniejszonej ekspresji receptora IL-7R wśród pacjentów z astmą leczonych GKS może wskazywać na to, że jednym z miejscowych mechanizmów działania tej grupy leków jest zmniejszanie wrażliwości na działanie IL-7, która potencjalnie może wywierać efekt proalergiczny [16].

WNIOSKI

Wyniki naszych badań sugerują, że limfocyty T obecne w drogach oddechowych pacjentów z astmą charakteryzują się zróżnicowanym potencjałem odpowiedzi na działanie IL-10 i IL-7.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Robinson D.S., Hamid Q., Ying S., Tsicopoulos A., Barkans J., Bentley A.M., Corrigan C., Durham S.R., Kay A.B.: Predominant TH2-like bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma. N Engl J Med 1992; 326: 298-304.

2.    Bentley A.M., Maestrelli P., Saetta M., Fabbri L.M., Robinson D.S., Bradley B.L., Jeffery P.K., Durham S.R., Kay A.B.: Activated T-lymphocytes and eosinophils in the bronchial mucosa in isocyanate-induced asthma. J Allergy Clin Immunol 1992; 89: 821-829.

3.    Leckie M.J., Jenkins G.R., Khan J., Smith S.J., Walker C., Barnes P.J., Hansel T.T.: Sputum T lymphocytes in asthma, COPD and healthy subjects have the phenotype of activated intraepithelial T cells (CD69+ CD103+). Thorax 2003; 58: 23-29.

4.    Lee Y.C., Lee K.H., Lee H.B., Rhee Y.K.: Serum levels of interleukins (IL)-4, IL-5, IL-13, and interferon-gamma in acute asthma. J Asthma 2001; 38: 665-671.

5.    Huang S.K., Xiao H.Q., Kleine-Tebbe J., Paciotti G., Marsh D.G., Lichtenstein L.M., Liu M.C.: IL-13 expression at the sites of allergen challenge in patients with asthma. J Immunol 1995; 155: 2688-2694.

6.    Humbert M., Durham S.R., Kimmitt P., Powell N., Assoufi B., Pfister R., Menz G., Kay A.B., Corrigan C.J.: Elevated expression of messenger ribonucleic acid encoding IL-13 in the bronchial mucosa of atopic and nonatopic subjects with asthma. J Allergy Clin Immunol 1997; 99: 657-665.

7.    Ceyhan B.B., Enc F.Y., Sahin S.: IL-2 and IL-10 levels in induced sputum and serum samples of asthmatics. J Investig Allergol Clin Immunol 2004; 14: 80-85.

8.    Robinson D.S., Tsicopoulos A., Meng Q., Durham S., Kay A.B., Hamid Q.: Increased interleukin-10 messenger RNA expression in atopic allergy and asthma. Am J Respir Cell Mol Biol 1996; 14: 113-117.

9.    Magnan A., van Pee D., Bongrand P., Vervloet D.: Alveolar macrophage interleukin (IL)-10 and IL-12 production in atopic asthma. Allergy 1998; 53: 1092-1095.

10.    Kurz T., Hoffjan S., Hayes M.G. i wsp.: Fine mapping and positional candidate studies on chromosome 5p13 identify multiple asthma susceptibility loci. J Allergy Clin Immunol 2006; 118: 396-402.

11.    Moniuszko M., Bodzenta-Łukaszyk A., Kowal K., Dabrowska M.: Bronchial macrophages in asthmatics reveal decreased CD16 expression and substantial levels of receptors for IL-10, but not IL-4 and IL-7. Folia Histochem Cytobiol 2007; 45: 181-189.

12.    Moniuszko M., Kowal K., Zukowski S., Dabrowska M., Bodzenta-Łukaszyk A.: Frequencies of circulating CD4+CD25+CD127low cells in atopics are altered by bronchial allergen challenge. Eur J Clin Invest 2008; 38: 201-204.

13.    Moniuszko M., Bodzenta-Łukaszyk A., Kowal K., Lenczewska D., Dabrowska M.: Enhanced frequencies of CD14++CD16+, but not CD14+CD16+, peripheral blood monocytes in severe asthmatic patients. Clin Immunol
(w druku).

14.    Moniuszko M., Edghill-Smith Y., Venzon D., Stevceva L., Nacsa J., Tryniszewska E., Tsai W.P., Franchini G.: Decreased number of CD4+ and CD8+ T cells that express the interleukin-7 receptor in blood and tissues of SIV-infected macaques. Virology 2006; 356: 188-197.

15.    Moniuszko M., Fry T., Tsai W.P., Morre M., Assouline B., Cortez P., Lewis M.G., Cairns S., Mackall C., Franchini G.: Recombinant interleukin-7 induces proliferation of naive macaque CD4+ and CD8+ T cells in vivo. J Virol 2004; 78: 9740-9749.

16.    Keskin G., Inal A., Musabak U., Sengul A., Ankara E.: Serum Interleukin-7 Levels In Patients With Allergic Asthma JACI, 117, S257-S257.

..............................................................................................................................................................

Objaśnienia:

IL - interleukina,
GKS - glukokortykosteroidy,
MFI (ang. mean fluorescencje intensity) - średnia intensywność fluorescencji,
BAL (ang. bronchio-alveolar lavage) - płukanie oskrzelikowo-pęcherzykowe,
IQR (ang. interquartile range) - rozstęp międzykwartylowy z próby.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Marcin Moniuszko
Klinika Alergologii i Chorób Wewnętrznych USK
15-276 Białystok,
ul. M. Skłodowskiej-Curie 24A
e-mail: moniuszm@umwb.edu.pl

Pracę nadesłano: 02.09.2008 r.
Przyjęto do druku: 25.09.2008 r.