WSTĘP

Immunoterapia swoista (SIT) jest jedyną, obok unikania ekspozycji na alergeny, metodą przyczynowego leczenia chorób alergicznych. Polega na wielokrotnym podawaniu osobie uczulonej stopniowo wzrastających dawek szczepionki alergenowej w celu złagodzenia objawów związanych z ekspozycją na dany alergen. Jej celem jest przywrócenie prawidłowej odpowiedzi immunologicznej i uzyskanie tolerancji immunologicznej i klinicznej alergenów. SIT zmienia naturalny przebieg choroby alergicznej, zapobiega powstawaniu nowych uczuleń, zapobiega również rozwojowi astmy u pacjentów z alergicznym nieżytem nosa. Odgrywa szczególną rolę w leczeniu chorób alergicznych i jest istotnym uzupełnieniem leczenia farmakologicznego.

Skuteczność immunoterapii może być rozpatrywana w dwóch aspektach: klinicznym i immunologicznym.

Efekty kliniczne wywołane przez SIT to:

• zmniejszenie objawów choroby alergicznej

• i ilości przyjmowanych leków (ocena skoringu, objawy/zużycie leków sms – symptom medication score),

• poprawa jakości życia (wyliczana na podstawie kwestionariusza),

• obniżenie swoistej reaktywności tkanek na alergen (hamowanie wczesnej i późnej fazy reakcji alergicznej).

• długoterminowe wyleczenie.

Parametry immunologiczne potwierdzające skuteczność SIT to:

• modulacja funkcji limfocytów T: supresja alergenowo swoistych limfocytów T, aktywacja regulatorowych limfocytów T (Treg), zwiększona synteza IL-10, TGF-β, supresja limfocytów Th2 i produkowanych przez nie cytokin, 

• początkowo wzrost a następnie spadek IgE,

• wzrost IgG4 i/lub IgA,

• zahamowanie komórek efektorowych (eozynofilów, bazofilów, komórek tucznych) i wygaszanie przewlekłego zapalenia alergicznego.

Jak dotąd nie znaleziono żadnego pojedynczego parametru immunologicznego pozwalającego na wiarygodne i jednoznaczne potwierdzenie skuteczności SIT oraz określenie osiągnięcia stanu tolerancji alergenu [1–5].

Immunoterapia swoista iniekcyjna (SCIT) jest stosowana od prawie 100 lat. Jest metodą dobrze poznaną, szeroko rozpowszechnioną, o udowodnionej skuteczności klinicznej. Jej mechanizm jest procesem złożonym. Efekty SIT są związane z jej wpływem na poszczególne poziomy odpowiedzi immunologicznej, funkcje limfocytów T, syntezę immunoglobulin i reaktywność komórek efektorowych. Podczas SCIT dochodzi do modulacji funkcji limfocytów T oraz zmiany profilu produkowanych cytokin, obniżenia stężenia cytokin produkowanych przez Th2: IL-4, IL-5, IL-13, wzrostu stężenia cytokin produkowanych przez  Th1: INF-γ, IL-12. Zmiana syntezy immunoglobulin polega na początkowym wzroście stężenia IgE, a następnie stopniowym obniżeniu jej poziomu oraz zmianie subklas przeciwciał IgG (z IgG1 na IgG4). Wykazano, że SCIT powoduje  zmniejszenie reaktywności komórek efektorowych (bazofilów, komórek tucznych, eozynofilów) i ich migracji do miejsca zapalenia.  Mechanizm tych zjawisk związany jest z aktywacją limfocytów regulatorowych wydzielających  IL-10 i TGF-β. Treg odgrywają istotną rolę w ograniczaniu reakcji alergicznej i nabywaniu tolerancji alergenu, a zatem decydują o skuteczności immunoterapii [1–7]. 

Immunoterapia podjęzykowa (SLIT) jest najbardziej polecaną metodą immunoterapii swoistej nieiniekcyjnej (tzw. miejscowej). W ostatnich latach rośnie zainteresowanie tą metodą leczenia. Przeprowadzono wiele badań potwierdzających jej skuteczności i bezpieczeństwo. Według raportu ARIA 2007 (Alergiczny nieżyt nosa i jego wpływ na astmę) obie metody SLIT i SCIT są rekomendowane u chorych z alergicznym nieżytem nosa (ANN), astmą oraz ANN i astmą. Metoda ta jest zalecana zwłaszcza u pacjentów z reakcjami systemowymi w czasie SCIT i/lub u tych nie akceptujących iniekcji. Bezpieczeństwo tej metody pozwala na podawanie szczepionki podjęzykowej w warunkach domowych, pod kontrolą lekarza.

Dotychczas nie obserwowano w przebiegu SLIT reakcji zagrażających życiu, objawy niepożądane miejscowe to obrzęk okolicy ust, dolegliwości żołądkowo-jelitowe, nieżyt nosa i spojówek, pokrzywka. Objawy ustępowały samoistnie lub po podaniu leków objawowych i nie powtarzały się po redukcji dawek. Mechanizmy immunologiczne immunoterapii podjęzykowej nie są dobrze poznane. Podkreśla się rolę komórek dendrytycznych błony śluzowej jamy ustnej, pełniących funkcję komórek prezentujących alergen i stymulujących limfocyty w obwodowych węzłach chłonnych podjęzykowych i szyjnych. Autorzy wielu prac wskazują na istotną rolę limfocytów Treg i wydzielanych przez nie cytokin IL-10 i TGF-β. Obserwowano również podczas SLIT spadek stężenia IL-13, IL-5 oraz wzrost syntezy IgG4 [8–14].

Nadal nie jest wyjaśnione czy immunoterapia podjęzykowa indukuje mechanizmy immunologiczne porównywalne z immunoterapią iniekcyjną? Celem badania była ocena stężenia IL-10, TGF-β, IL-13 oraz aktywności supresyjnej limfocytów T (SAT) u pacjentów odczulanych drogą podjęzykową (SLIT) i podskórną (SCIT).

MATERIAŁ I METODY

Badaniem objęto 35 dzieci (11 dziewcząt i 24 chłopców) w wieku 7–17 lat, pozostających pod stałą opieką Poradni Alergologicznej przy Klinice Pediatrii, Nefrologii i Alergologii Dziecięcej WIM. U wszystkich chorych potwierdzono IgE-zależny mechanizm choroby na podstawie punktowych testów skórnych oraz alergenowo swoistych IgE w surowicy.

Do badania zakwalifikowano 7 dzieci z alergicznym nieżytem nosa, 5 z astmą oraz 23 z astmą i alergicznym nieżytem nosa, uwzględniając wskazania i przeciwwskazania zgodnie z wytycznymi Europejskiej Akademii Alergologii i Immunologii Klinicznej (EAACI) [15]. Alergenami odpowiedzialnymi za objawy chorobowe w grupie badanej były: roztocze kurzu domowego u 16 dzieci oraz pyłki traw i żyta u 19 dzieci. Na przeprowadzenie badania uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy Wojskowej Izbie Lekarskiej w Warszawie Nr 23/06.

Chorzy zostali losowo podzieleni na dwie grupy: 21 otrzymywało szczepionkę metodą iniekcyjną (Purethal, Novo-Helisen Depot, Allergovit), 14 drogą podjęzykową (Staloral 300) zgodnie ze schematami podawania zalecanymi przez producentów. W trakcie immunoterapii swoistej stosowano standardowe leczenie farmakologiczne astmy i alergicznego nieżytu nosa oraz równocześnie stosowano premedykację lekami przeciwhistaminowymi.

Próbki krwi do badań immunologicznych pobierano dwukrotnie, w okresie poprzedzających rozpoczęcie odczulania oraz po upływie 3 miesięcy immunoterapii. Po izolacji komórek mononuklearnych z krwi zakładano mikrohodowle (PBMC) zgodnie z metodą opisaną uprzednio [16–18], w których po 72 godzinach hodowli oznaczano aktywność supresyjną limfocytów T (wskaźnik SAT) oraz przy zastosowaniu metody ELISA (zestawy Quantikine) oznaczano w nadsączach stężenie IL-10, TGF-β oraz IL-13. Badania immunologiczne wykonywano w Pracowni Immunologii Zakładu Ochrony Mikrofalowej Wojskowego Instytutu Higieny i Epidemiologii w Warszawie. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Przyjęto poziom istotności statystycznej jako p<0,05.

WYNIKI

Stężenie IL-10 w grupie chorych otrzymujących szczepionkę alergenową metodą iniekcyjną przed leczeniem wynosiło średnio 222,52 pg/ml (SD – 83,89), a po leczeniu wzrosło do wartości 257,28 pg/ml (SD – 86,25); różnica wartości jest statystycznie znamienna p<0,003. W grupie chorych otrzymujących szczepionkę alergenową metodą podjęzykową, wartości średnie IL-10 przed leczeniem wynosiły 224,42 pg/ml (SD – 91,85), a po 3 miesiącach wzrosły do wartości 275,76 pg/ml (SD – 58,4); różnica jest statystycznie znamienna p<0,01.

Wartości stężeń TGF-β w grupie chorych otrzymujących szczepionkę alergenową metodą iniekcyjną przed leczeniem wynosiły 101,28 pg/ml (SD  –  35,36), a po 3 miesiącach wzrosły do poziomu 104,04 pg/ml (SD – 23,34); różnica jest statystycznie nieznamienna p=0,31. W grupie chorych otrzymujących szczepionkę alergenową metodą podjęzykową wartości średnie TGF-β przed leczeniem wynosiły 96,50 pg/ml, a po 3 miesiącach wzrosły do wartości 101,61 pg/ml (SD – 24,90); różnica jest statystycznie nieznamienna p=0,277.

Wartość wskaźnika SAT u chorych otrzymujących szczepionkę alergenową metodą iniekcyjną wynosiła średnio przed leczeniem 21,13% (SD – 12,91),
a po 3 miesiącach wzrosła do wartości 26,81% (SD –  8,95); różnica jest statystycznie znamienna p<0,009. Wskaźnik ten u chorych otrzymujących szczepionkę alergenową metodą podjęzykową wynosił przed leczeniem średnio 22,99% (SD – 11,82), a po 3 miesiącach leczenia wzrósł nieznacznie do wartości 24,73% (SD – 9,82); różnica jest statystycznie nieznamienna p=0,412.

Wartości stężeń IL-13 w grupie chorych leczonych szczepionką alergenową metodą iniekcyjną wynosiły średnio przed leczeniem 157,73 pg/ml (SD – 53,33) a po leczeniu obniżyły się do wartości 104,14 pg/ml (SD – 54,21); różnica była statystycznie znamienna p<0,001. W grupie leczonych szczepionką alergenową metodą podjęzykową wartości średnie IL-13 przed leczeniem wynosiły 151,26 pg/ml (SD –  47,15), a po 3 miesiącach obniżyły się do 108,47 pg/ml (SD – 33,60); różnica była statystycznie znamienna p<0,01.

Stężenie IL-10 i TGF-β (ryc. 1 i 2) w nadsączach z mikrohodowli po 3 miesiącach immunoterapii wzrosło w obu grupach. Zaobserwowano również wzrost wskaźnika SAT (ryc. 3) reprezentującego zdolności immunoregulacyjne limfocytów T. Stężenie IL-13 obniżyło się w obu grupach (ryc. 4).

DYSKUSJA

W pracy oznaczano stężenia IL-10, TGF-β, IL-13 oraz aktywność supresyjną limfocytów T (wskaźnik SAT) u pacjentów podczas immunoterapii swoistej metodą iniekcyjną i podjęzykową. Wykazano, że w obu grupach po 3 miesiącach immunoterapii, wzrosły stężenia IL-10 i TGF-β w nadsączach hodowli PBMC oraz, że równolegle wzrosły wartości wskaźnika SAT. Uprzednio wykazano [19], że pomiędzy aktywnością SAT a produkcją IL-10 i TGF-β zachodzi związek korelacyjny, stanowiący wyraz mechanizmu, poprzez który regulacyjne limfocyty T (Treg) wytwarzając wspomniane cytokiny, realizują swe wpływy immunoregulacyjne [20–22].

Można zatem przyjąć, że zastosowanie podjęzykowej i podskórnej immunoterapii swoistej prowadzi u pacjentów z chorobami alergicznymi do pobudzenia aktywności immunoregulacyjnej limfocytów T, skutkującej złagodzeniem klinicznych objawów alergii. Towarzyszące tym zmianom obniżenie wytwarzania pro-zapalnej cytokiny IL-13 potwierdza przyjętą interpretację mechanizmów obserwowanej poprawy klinicznej po zastosowaniu obu metod immunoterapii swoistej.

Limfocyty Treg biorą udział w kontroli reakcji alergenowo swoistej poprzez następujące mechanizmy:

a) hamując prezentację antygenu,
b) redukując aktywności efktorowych limfocytów Th1 i Th2,
c) obniżając wytwarzanie alergenowo-swoistych IgE,
d) hamując aktywność komórek tucznych, bazofilów i eozynofilów,
e) indukując wytwarzanie IgG4 i/lub IgA.

Wyróżnia się trzy subpopulacje limfocytów Treg: limfocyty T CD4+CD25+Foxp3+ rozwijające się w grasicy i znane jako naturalne Treg, limfocyty Tr1, wydzielające głównie IL-10 i TGF-β, oraz limfocyty Th3, które wytwarzają TGF-β. Limfocyty Tr1 i Th3 określa się jako indukowalne regulatorowe limfocyty T [23]. Limfocyty Th3 wykazują działanie immunosupresyjne poprzez  TGF-β, jak również indukują ekspresję Foxp3 (marker komórek Treg) i w ten sposób mogą wpływać na wzrost liczby Treg. Mikrośrodowisko jelitowe wydziela duże ilości TGF-β i może odgrywać kluczową rolę w pozagrasiczej generacji Foxp3 (po doustnym podaniu alergenu). Naturalne limfocyty T regulatorowe prawdopodobnie utrzymują systemową homeostazę i zapobiegają rozwojowi autoimmunizacji.

Według Noriko i współpracowników w mechanizm rozwoju doustnej tolerancji alergenu włączone są wszystkie subpopulacje limfocytów Treg, natomiast rola poszczególnych komórek w indukcji i stabilizacji lokalnej oraz systemowej nadal nie jest poznana [3].

Subpopulacje limfocytów T – Th1, Th2 i Tr1 są obecne zarówno u osób zdrowych jak i u osób z alergią, ale w różnych proporcjach. Zmiana subpopulacji dominującej i równowaga między Th2 i Treg może prowadzić do indukcji tolerancji alergenu. Badania nad ich mechanizmami wykazały, że limfocyty regulatorowe dominują u osób zdrowych. 

WNIOSKI

1. Wyniki badania sugerują, że istotną rolę w obu metodach immunoterapii SCIT i SLIT   odgrywa wzrost aktywności limfocytów T regulatorowych, wyrażony zwiększeniem aktywności supresyjnej i wzmożeniem wytwarzania cytokin – IL-10 i TGF-β.

2. Obniżenie stężeń IL-13 wskazuje w obu metodach na porównywalną supresję limfocytów Th2.

3. W odniesieniu do wybranych parametrów immunologicznej oceny zapalenia alergicznego oddziaływanie obu metod immunoterapii swoistej (SCIT i SLIT) opiera się o podobne mechanizmy i prowadzi do podobnych korzyści klinicznych.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Woodfolk J.A.: T-cell responses to allergens. Allegy and Clinical Immunology 2007; 119,  2: 280-294. 

2.    Jutel M.: Patofizjologiczne podstawy immunoterapii swoistej. Postępy Dermatologii i Alergologii 2003; XX, 3: 125-129.

3.    Noriko M., Kosaka T. and C.: Oral tolerance: intestinal homeostasis and antigen-specific regulatory T cells. Trends Immunology 2008; 29: 11: 532-540.

4.    Robinson D.S., Larche M., Durham S.R.: Tregs and allergic disease. J Clin Invest 2004; 114: 1389-1397.

5.    Akdis M., Verhagen J., Taylor A. i wsp.: Immune responses in healthy and allergic individuals are characterized by a fine balance between allergen-specific T regulatory 1 and T helper 2 cells. J Exp Med 2004; 199: 1567-1575.

6.    Akdis M., Akdis C.A.: Mechanismsof allergen-specific immunotherapy. Allegy and Clinical Immunology 2007; 119, 4: 780-789.

7.    Jutel M., Akdis M., Budak F. i wsp.: Il-10 and TGF-β
cooperate in the regulatory T cell response to mucosal allergens in normal immunity and specific immunotherapy. Eur J Immunol 2003; 33 (5): 1205-1214.

8.    Passalacgua G., Durham S.: Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma update: Allergen Immunotherapy 2007; JACI 2007; 119: 881-891.

9.    Akdis C.A., Barlan I.B., Bahceciler N. i wsp. Immunological mechanism of sublingual Immunotherapy. Allergy 2006; 61 (Suppl. 81): 11-14.

10.    Ciprandi G., Fenoglio D., Ignazio C. i wsp.: Induction of interleukin 10 by sublingual immunotherapy for house dust mites: a preliminary report. Ann Allergy Asthma Immunol 2005; 95: 38-44.

11.    Marogna M., Spadolini I., Massolo A. i wsp.: Clinical, functional and immunologic effects of sublingual immunotherapy in birch pollinosis: a 3-year randomized controlled study. J Allergy Clin Immunol 2005; 115: 1184-1188.

12.    Stanowisko ekspertów PTA nt. immunoterapii podjęzykowej. Alergia Astma Immunologia 2007; 12 (4): 181-183.

13.    Kaczmarek J., Stelmach I.: Skuteczność, bezpieczeństwo i mechanizmy działania podjęzykowej immunoterapii alergenowej  – aktualny stan wiedzy. Pediatria Polska 2007; 82 (8): 635-641.

14.    Bohle B., Kinaciyan T., Gerstmayr M. i wsp.: Sublingual immunotherapy induces Il-10- producing T regulatory cells, Allergen specific T-cell tolerance and immune deviation. Allergy and Clinical Immunology 2007; 120, 3: 707-713.

15.    Standardy praktycznej immunoterapii swoistej 2007 wg EAAIC. Medycyna Praktyczna – wydanie specjalne 3/2007.

16.    Dąbrowski M. P., Dąbrowska-Bernstein B. K., Stasiak A i wsp.: Immunological and clinical evaluation of multiple sclerosis patients treated with corticosteroids and/or thymic hormones. Annals N.Y. Acad Sci, 1987; 496: 697-706.

17.    Dąbrowski M. P., Stankiewicz W., Płusa T. i wsp.: Competition of Il-1 and IL-1ra determines lymphocyte response to delayed stimulation with PHA. Mediators of Inflammation 2001; 10: 101-107.

18.    Stankiewicz W., Dąbrowski M. P., Chciałowski A. i wsp.: Cellular and cytokine immunoregulation in patients with chronic obstructive pulmonary disease and bronchial asthma. Mediators of Inflammation 2002; 11: 307-312.

19.    Stankiewicz W.: Zaburzenia immunoregulacyjne
w przewlekłym zapaleniu zatok przynosowych – znaczenie kliniczne i terapeutyczne. Praca habilitacyjna. Centrum Zdrowia Matki Polki, Łódź 2008.

20.    Seddon B., Mason D.: The third function of the thymus. Immunol Today, 2000; 21: 95-98.

21.    Shevach E. M.: Regulatory T cells in autoimmunity. Ann Rev Immunol 2000; 18: 423-427.

22.    Jonuleit H. i wsp.: Dendritic cells as a tool to induce anergic and regulatory T cells. Trends in Immunol 2001; 7: 394-397.

23.     Lasek W., Jakóbisiak M. Populacje z subpopulacje limfocytów. Immunologia. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., Stokłosa T. (red.) PWN, Warszawa 2007; 11: 172-190.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji

Anna Grad
Klinika Pediatrii, Nefrologii i Alergologii
Dziecięcej Wojskowego Instytutu Medycznego
00-909 Warszawa, ul. Szaserów 128
tel/fax: 022 681 67 63
e-mail: grad@mlociny.pl 

Pracę nadesłano: 28.01.2009 r.
Przyjęto do druku: 04.03.2009 r.