WPROWADZENIE

Interleukina-18 (IL-18) jest cytokiną prozapalną biorącą udział w przewlekłych procesach chorobowych, w tym w chorobach z autoagresji, nowotworach a także w chorobach infekcyjnych [1]. Ekspresja IL-18 obecna jest w wielu komórkach takich jak: makrofagi, komórki dendrytyczne, komórki Kupffera, keratynocyty, osteoblasty, komórki nadnerczy, komórki nabłonkowe, mikrogleju i fibroblasty [2–6].

IL-18 odgrywa ważną rolę w aktywacji limfocytów Th1, bierze więc udział w chorobach o przewadze aktywacji tych komórek [7, 8]. Jednakże pewne doniesienia wskazują na to, że IL-18 potencjalnie indukuje produkcję cytokin Th2 zależnych (IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13), immunoglobulin (Ig) E oraz IgG1 [7, 9, 10, 11]. Dane te sugerują, że interleukina ta może torować drogę Th1 lub Th2 zależną. Prozapalna rola IL-18 nie jest więc łatwa do przewidzenia właśnie z uwagi na możliwość aktywacji zarówno drogi zależnej od limfocytów Th1 jak i Th2. IL-18 może także powodować aktywację układu granulocytów w płucach – i co za tym idzie – uszkodzenie śródmiąższu płuc [1]. Przemawia za tym zwiększenie stężenia IL-18 w środowisku płuc chorych na sarkoidozę [12]. U chorych na astmę obserwowano zmniejszone stężenia IL-18, jakkolwiek należy podkreślić udział tej interleukiny w różnicowaniu limfocytów w kierunku Th2 i możliwość udziału w zapaleniu
w przebiegu astmy [13].

Hoshino i wsp. obserwowali w pracach na modelach zwierzęcych, że nadprodukcja IL-18 może indukować w płucach myszy takie zmiany jak, procesy zapalane, włóknienie i rozedmę.

Nadprodukcja ta prowadziła do wzrostu wydzielania interferonu-gamma, IL-5 i IL-13, z towarzyszącym przewlekłym stanem zapalnym w tkance płucnej, naciekiem komórek CD8+, makrofagów, neutrofili i eozynofili. Obserwowane było narastanie objętości płuc, zmiany rozedmowe oraz nadciśnienie płucne  [14]. W dostępnym piśmiennictwie jest bardzo mało opracowań donoszących o wpływie IL-18 na procesy zapalne toczące się w płucach chorych na przewlekłą obturacyjną chorobę płuc (POChP).

W ocenie stanu zapalnego u chorych na POChP duże znaczenie odgrywa badanie indukowanej plwociny [15]. Badanie to ma również znaczenie w diagnostyce różnicowej między astmą a POChP.  Analiza składu komórkowego może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na pytanie o zasadność leczenia glikokortykosteroidami, które wydaje się słuszne w przypadku zwiększenia odsetka eozynofilów w plwocinie u chorego na POChP.

Celem obecnego badania była ocena stężenia IL-18 w plwocinie indukowanej (PI) oraz  poszukiwanie korelacji pomiędzy stężeniem IL-18 a składem komórkowym PI oraz parametrami czynnościowymi układu oddechowego.

MATERIAŁ I METODY

Do badania włączono osoby ze stabilną postacią POChP i osoby chorująca na astmę oskrzelową. Zarówno w pierwszej jak i drugiej grupie były osoby
w stabilnym okresie choroby. Z badania wykluczone zostały osoby po przebytej infekcji (do 5 tygodni) oraz stosujące glikokortykoidy systemowe w czasie ostatnich 6 tygodni. Badani chorzy wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniu, które było zaaprobowane przez Komisję Bioetyczną Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Rozpoznanie POChP ustalono według kryteriów GOLD [www.goldcopd.com]. U tych chorych wykluczono astmę na podstawie wywiadu klinicznego i próby odwracalności badania spirometrycznego.

U każdego chorego wykonano badanie spirometryczne (Lungest 1000MES) i pletyzmograficzne (UMAX 6200, Sensor Medics). Przedmiotem badania  była ocena stężenia IL-18 w plwocinie indukowanej. Jako skuteczną indukcję oceniano uzyskanie co najmniej 2 mL wydzieliny, a pod względem oceny cytologicznej – obecność nie więcej niż 50% komórek nabłonka płaskiego w preparacie. Ostatecznie do badania włączono chorych, których wynik badania plwociny spełniał te kryteria i było to 15 chorych na POChP i 10 chorych na astmę. Średnia wieku badanych osób wynosiła w grupie na POChP– 67 lat (54–81), na astmę– 39 lat (19–76). Wszyscy badani na POChP byli palaczami: 7 aktywnych i 9 ex- palaczy, średnia liczba paczko-lat wynosiła 42,5. Chorzy na astmę nie byli palaczami. Wyniki badań czynnościowych podano w tabeli I.

Indukcję plwociny wykonano według obowiązujących zasad [15]. Plwocinę indukowano przy wykorzystaniu roztworu NaCL we wzrastających stężeniach (3, 4, 5%). Nebulizacja każdym roztworem trwała 5 minut. Po każdej nebulizacji wykonywano badanie spirometryczne celem kontroli parametru FEV1. Indukcję przerywano po odkrztuszenu plwociny (co najmniej 2 ml) lub wystąpienia spadku FEV1 o ponad 20% w stosunku do wyjściowego badania, lub spadku saturacji krwi poniżej 90%, lub tachykardii ponad 120/min, lub przy wzroście ciśnienia tętniczego ponad 160/95mmHg.

Materiał zaraz po uzyskaniu był przekazywany do Pracowni Cytologii, gdzie  poddawany był obróbce laboratoryjnej zgodnie z protokołem [15]. Na wstępie materiał był poddawany homogenizacji przy pomocy 0,1% roztworu dithiothreitolu (DTT), następnie filtrowany, przepłukiwany i wirowany. Z osadu komórkowego wykonywano preparaty, które barwiono metodą May Grunwalda Giemsy. Następnie wyliczana była całkowita liczba komórek oraz odsetek komórek nabłonkowych i nienabłonkowych. Stężenie IL-18 oznaczono w uprzednio zamrożonych nadsączach metodą immunoenzymatyczną ELISA (R&D).

Analizę statystyczną przeprowadzono z wykorzystaniem programu Statistica, korelacje sprawdzano testem współczynnika korelacji Spearmana (jako istotne statystycznie zależności przyjęto R ≥ 0,4, p<0,05).
   
WYNIKI

Analizując wyniki badań czynnościowych stwierdzono różnice pomiędzy chorymi na POChP i na astmę w zakresie wszystkich parametrów, przy czym statystycznie istotne była różnica w zakresie FEV1%, FVC% i FEV1%FVC (tab. I). W grupie chorych na POChP stwierdzono istotną dodatnią korelację pomiędzy liczbą paczkolat a objętością zalegającą (RV) (R=0,68, p<0,05).

W tabeli II przedstawiono skład komórkowy plwociny. Plwocina indukowana od chorych na POChP zawierała istotnie więcej komórek niż u chorych na astmę (p<0,05). Liczba i odsetek neutrofili były większe u chorych na POChP w porównaniu do chorych na astmę (p<0.05). Stwierdzono istotną korelację całkowitej liczby komórek w plwocinie, liczby limfocytów i liczby neutrofili z całkowitą pojemnością płuc (TLC) (R=0,6, p<0,05) w grupie chorych na POChP. W tej grupie chorych zaobserwowano istotną korelację odsetka neutrofili ze spadkiem objętości wydechowej pierwszosekundowej FEV1 (R=- 0,6, p<0,05).

Stężenie IL -18 nie różniło się pomiędzy grupami badanymi i wynosiło średnio: w grupie chorych na POChP- 22,4 pg/ml (3,7-47,2 pg/mL), w grupie chorych na astmę- 21,7 (5,0-53,3 pg/mL). Stężenie to było odwrotnie proporcjonalne do liczby i odsetka limfocytów (rycina 1, wartość korelacji nieistotna statystycznie, R= -0.3). Odnotowano natomiast tendencję do korelacji stężenia IL-18 z odsetkiem eozynofili, która była wyraźnie wyrażona w grupie chorych na astmę (R=0,55, nieistotne statystycznie).

DYSKUSJA

W niniejszym opracowaniu przedstawiliśmy wyniki badania stężenia IL-18 w plwocinie indukowanej u chorych na POChP w kontekście zależności od składu komórkowego plwociny i wyników badań czynnościowych układu oddechowego.

Uzyskane wyniki potwierdziły właściwy dobór grupy badanej, wyniki badań czynnościowych korelowały z liczbą paczkolat, zaś typowe komórki zapalne występowały w zwiększonej liczbie, bądź odsetka u chorych z nasileniem zmian obturacyjnych. Należy zaznaczyć, że w pracy posługiwaliśmy się również wynikami badania pletyzmograficznego, które w sposób właściwy obrazuje zmiany czynnościowo-strukturalne w układzie oddechowym chorych na POChP.    

Nie znaleziono statystycznie istotnej korelacji pomiędzy poziomem IL-18 a liczbą komórek zapalnych w IP, a jedynie tendencję do ujemnej zależności pomiędzy IL-18 a liczbą limfocytów i tendencję do korelacji z odsetkiem eozynofili. Nie znaleziono także istotnych korelacji pomiędzy stężeniem IL-18 a parametrami czynnościowymi układu oddechowego.

Imaoka i wsp. przebadali 62-osobową grupę chorych na POChP w stadium I- IV wg GOLD, 34 zdrowych palaczy i 23 zdrowych niepalących osób. Uzyskali oni następujące wyniki: stężenie tej interleukiny we krwi było znacząco wyższe w grupie chorych na POChP oraz w grupie palaczy w porównaniu do osób niepalących. Co więcej, stężenie IL-18 było wyższe w III i IV stadium POChP niż u palaczy i niepalących [16]. Podobnie Petersen i wsp. wykazali wyższe stężenie IL-18 w surowicy w grupie 20 chorych na POChP w porównaniu z 20-osobową grupą kontrolną. [17].

McKay i wsp. przebadali grupę chorych na astmę (palących i niepalących) oraz zdrowych palaczy i osoby niepalące pod kątem stężenia IL-18 w indukowanej plwocinie. Średnie stężenie IL-18 w tej pracy było podobne do uzyskanego przez nas [18]. Ponadto stwierdzono znacznie mniejsze stężenie u palaczy chorych w porównaniu do osób niepalących. Nie było zależności od składników komórkowych plwociny. Ostatnio ukazała się praca Rovina i wsp., którzy wykonali podobne do naszego badanie, stwierdzili zwiększone stężenie IL-18 u chorych na POChP w porównaniu do zdrowych, jednakże również nie wykazali związku stężenia IL-18 z liczbą komórek zapalnych w plwocinie u chorych na POChP [19].

W naszym badaniu zaobserwowaliśmy pewną tendencję do ujemnej korelacji stężenia IL-18 z liczbą i odsetkiem limfocytów. W badaniu u chorych na sarkoidozę i chorych na alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych R. Mróz i wsp. stwierdzili dodatnią korelację stężenia IL-18 z odsetkiem limfocytów w płynie z płukania oskrzelowo- pęcherzykowego [20]. Rozbieżności między wynikami naszymi i cytowanych autorów wynikają z badania innej jednostki chorobowej o innym patomechanizmie i badania innej przestrzeni dróg oddechowych, które reprezentują składniki plwociny indukowanej. Badanie stężenia cytokin jako składnika fazy pozakomórkowej plwociny indukowanej obarczone może być bowiem pewnym błędem wynikającym m.in. z pochodzenia i obróbki materiału [15]. To może tłumaczyć brak takich wyraźnych zależności jakie obserwowali inni badacze badając płyn z płukania oskrzelowo- pęcherzykowego lub krew obwodową.

Ciekawą obserwacją w naszej pracy jest dość znaczny odsetek eozynofili w plwocinie u chorych na POChP. Rola tych komórek w patomechanizmie POChP podnoszona jest ostatnio w wielu badaniach [21]. Wszyscy nasi pacjenci byli palaczami, a palenie indukuje napływ eozynofili do dróg oddechowych. Rolę tych komórek w zapaleniu w POChP potwierdziły dodatkowo inne wyniki naszej pracy: zaobserwowaliśmy pewną zależność liczby eozynofili ze spadkiem FEV1 i wzrostem TLC (R=0.5, nieistotne statystycznie). W tym kontekście zależność stężenia IL-18 z odsetkiem eozynofili uzasadnia prowadzenie dalszych badań nad rolą tego szlaku zapalanego u chorych na POChP. W przeciwieństwie do wyników innych autorów stężenie IL-18 u chorych na astmę w naszym badaniu nie różniło się od chorych na POChP. Natomiast dość silny związek z odsetkiem eozynofili w grupie chorych na astmę potwierdza potencjalną rolę IL-18  w zapaleniu typowym dla tej choroby.

Podsumowując, w naszej pracy stwierdziliśmy obecność IL-18 w plwocinie indukowanej u chorych w stabilnym okresie POChP.  Odwrotnie proporcjonalna zależność stężenia tej cytokiny od limfocytów i korelacja z odsetekim eozynofili 
w drogach oddechowych wskazuje na możliwy udział jej w przebiegu zapalenia w POChP, wymaga jednak pogłębienia badań na ten temat.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Alastair G.J., Robertson S.E., Mclnnes B.: Interleukin-18.Journal of Leukocyte Biology 73, 2003; 73: 213-224.

2.    Nakamura K., Okamura H., Wada M., Nagata K., Tamura T.: Endotoxin-induced serum factor that stimulates gamma interferon production. Infect. Immun. 1989; 57: 590-595.

3.    Kim Y.M., Kang H.S., Paik S.G., Pyun K.H., Anderson K.L., Torbett B.E., Choi I.: Roles of IFN consensus sequence binding protein and PU.1 in regulating IL-18 gene expression. J Immunol 1999; 163: 2000-2007.

4.    Okamura H., Tsutsi H., Komatsu T., Yutsudo M., Hacura A., Tanimoto T., Torigoe K., Okura T., Nukada Y., Hattori K. i wsp.: Cloning of a new cytokine that induced IFN gamma production by T cells. Nature 1995; 378: 88-91.

5.    Tone M., Thompson S.A., Tone Y., Fairchild P.J., Waldmann H.: Regulation of 1l-18 (IFN-gamma – Inducing factor) gene expression. J Immunol 1997; 159: 6156-6163.

6.    Puren A.J., Fantuzzi G., Dinarello C.A.: Gene expression, synthesis, and secretion of interleukin 18 and interleukin 1beta are differentially regulated in human blood mononuclear cells and mouse spleen cells. Proc Natl Acad Sci 1999; 96: 2256-2261.

7.    Nakanishi K., Yoshimoto T., Tsutsui H., Okamura H.: Interleukin-18 regulates both Th1-Th2 response. Annu Rev Immunol 2001; 19: 423-474.

8.    Dinarello C.A.: IL-18: a, Th-1-inducing, proinflamatory cytokine and new member of the IL-1 family. J. Allergy Clin Immunol 1999; 103: 11-24.

9.    Hashioto T., Wiltrout R.H., Young H.A.: IL-18 is a potent coinducer of IL-13 in NK and T cells: a new potential role of IL-18 in modulating the immune response. J Immunol 1999; 162: 5070-5077.

10.    Hoshino T., Kawase Y., Okamoto M., Yokota K., Yashino K., Yamamura K., Miyazaki J., Young H.A., Oizumi K., Cutting edge: IL-18-transgenic mice: in vivo evidence of a broad role of IL-18 in modulatineg immune function. J Immunol 2001; 166: 7014-7018.

11.    Hoshino T., Yagita H., Ortaldo J.R., Wiltrout R.H., Young H.A.: In vivo administraction of IL-18 can induce IgE production through Th2 cytocine induction and up-regulation of CD40 ligand (CD154) expression on CD4+ T cells. Eur J Immunol 2000; 30: 1998-2006.

12.    Shigehara K., Shijubo N., Ohmichi, M. i wsp.: Increased levels of IL-18 in patients with pulmonary sarcoidosis. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 1979-1982.

13.    Ho L.P., Davis M., Denison A., Wood F.T., Greening A.P.: Reduced interleukin-18 levels in BAL specimens from patients with asthma compared to patients with sarcoidosis and healthy control subjects. Chest 2002; 121: 1421-1426.

14.    Hoshino T., Kato S., Oka N., and Pulmonary Inflamation and Emphysema: Role of the Cytokines IL-18 nad IL-13. Am J Respir Crit Care Med 2007; 176: 49-62.

15.    Chmielowicz B., Obojski A., Barczyk A. i wsp.: Wskazówki metodologiczne Polskiego Towarzystwa Chorób Płuc odnośnie do wykonywania
i oceny plwociny indukowanej. Pneumonologia Alergologia Polska 2008; 76: 378-395.

16.    Imaoka H., Hashino T., Takei S., Kinoshita T., Okamoto M., Kawayama T., Kato S., Iwasaki H., Watanabe K., Aizawa H.: Interleukin-18 production and pulmonary function in COPD. Eur Respir J 2008 ; 31 (2): 287-97.

17.    Petersen A.M., Penkowa M., Iversen M., Frydelund-Larsen L., Andersen J.L., Mortensen J., Lange P., Pedersen B.K.: Elevated levels of IL-18 in plasma and skeletal muscle in chronic obstructive pulmonary disease. Lung 2007; 185 (3): 161-171.

18.    McKay A., Komai-Koma M., McLeod K.J., Campbell C.C., Kitson S.M., Chaudhuri R., Thomson L., McSharry C., Liew F.Y., Thomson N.C.: Il-18 levels In induced sputum are reduced In asthmatic and normal smokers. Clin Exp Allergy 2004; 34 (6): 904-910.

19.    Rovina N., Dima E., Gerassimou C., Kollintza A., Gratziou C., Roussos C.: Interleukin-18 in induced sputum: Association with lung function in chronic obstructive pulmonary disease. Respir Med 2009; 103 (7): 1056-1032.

20.    Mroz R.M., Kornikluk M., Stasiak-Barmuta A., Chyczewska E.: Upregulation of Th1 cytokine profile in BAL fluid of patients with hypersensitivity pneumonitis. J Physiol Pharmacol 2008; 59 (suppl 6): 499-505.

21.    Górska K., Krenke R., Korczyński P., Kościuch J., Domagala-Kulawik J., Chazan R.: Eosinophilic airway inflammation in COPD and asthma. J Physiol Pharmacol 2008, 59 (suppl 6): 261-271.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Joanna Domagała- Kulawik
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych,
Pneumonologii i Alergologii
Warszawski Uniwersytet Medyczny
02-097 Warszawa, ul. Banacha 1A
tel.: +48 022 599 12 43
e-mail: domagalakulawik@gmail.com

Pracę nadesłano: 16.06.2009 r.
Przyjęto do druku: 03.07.2009 r.